【摘要】：背景:神經(jīng)膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤,約占原發(fā)性腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤的80%。具有高侵襲性,易復(fù)發(fā),高死亡率等特性。雖然近年來顯微外科技術(shù)、神經(jīng)影像技術(shù)以及放化療治療方案等方面均取得了長足的進(jìn)步,但對于膠質(zhì)瘤患者,尤其是高級別的膠質(zhì)瘤患者,預(yù)后仍然不佳。因此,需要進(jìn)一步深入了解膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制,探索新的膠質(zhì)瘤分子及靶向治療方法。隨著近年來對miRNA研究的深入,其在包括膠質(zhì)瘤在內(nèi)的多種腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用日益凸顯。miR-218-5p在多種癌癥中表達(dá)下調(diào),并與臨床分期、預(yù)后和轉(zhuǎn)移相關(guān)。miR-218-5p在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及其分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。目的:1.通過分析膠質(zhì)瘤中差異表達(dá)miRNA選取miR-218-5p為研究對象,分析miR-218-5p在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)及與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后之間的關(guān)系。2.通過以U251細(xì)胞為研究對象研究miR-218-5p對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移及凋亡的影響。3.預(yù)測并驗證miR-218-5p的靶基因為HMGB1,研究miR-218-5p抑制膠質(zhì)瘤生長的分子機(jī)制。通過動物實驗驗證miR-218-5p在體內(nèi)對膠質(zhì)瘤生長的影響及miR-218-5p與HMGB1的靶向關(guān)系。方法:1.利用生物信息學(xué)方法篩選膠質(zhì)瘤中差異表達(dá)miRNA,通過實時熒光定量PCR法檢測miR-218-5p在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)。分析膠質(zhì)瘤中miR-218-5p表達(dá)水平與臨床預(yù)后之間的關(guān)系。2.以U251為研究對象,通過轉(zhuǎn)染miR-218-5p mimic過表達(dá)miR-218-5p,利用CCK-8實驗、細(xì)胞劃痕愈合實驗、Transwell小室實驗、流式細(xì)胞術(shù)分別檢測miR-218-5p對U251細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和凋亡的影響。3.利用生物信息學(xué)方法預(yù)測并篩選出miR-218-5p的靶基因HMGB1。通過qRT-PCR法檢測HMGB1在膠質(zhì)瘤組織及細(xì)胞中的表達(dá)。利用雙熒光素酶靶基因報告實驗驗證miR-218-5p與HMGB1的靶向關(guān)系。4.構(gòu)建裸鼠皮下膠質(zhì)瘤移植模型及Wistar大鼠顱內(nèi)原位膠質(zhì)瘤模型,通過瘤內(nèi)注射agomir-218-5p過表達(dá)miR-218-5p,通過頭顱能譜CT掃描觀察腫瘤大小,HE染色觀察病理學(xué)改變,Western Blot和免疫組化檢測HMGB1以及增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果:1.通過GEO數(shù)據(jù)篩選出目的miRNA為miR-218-5p,通過QRT-PCR分析結(jié)果顯示miR-218-5p在膠質(zhì)瘤及正常腦組織中差異表達(dá),在膠質(zhì)瘤中表達(dá)下調(diào)。膠質(zhì)瘤中miR-218-5p的表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后相關(guān),miR-218-5p低表達(dá)提示膠質(zhì)瘤患者預(yù)后不良。2.CCK-8細(xì)胞增殖實驗顯示miR-218-5p能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。3.細(xì)胞劃痕愈合實驗及Transwell小室實驗結(jié)果顯示miR-218-5p能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲及遷移。4.流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示miR-218-5p能誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡。5.預(yù)測表明HMGB1可能是miR-218-5p的靶基因,HMGB1在膠質(zhì)瘤中明顯上調(diào)表達(dá)。雙熒光素酶靶基因驗證實驗結(jié)果顯示,miR-218-5p可能通過與HMGB1 mRNA 3'UTR上的位點(diǎn)結(jié)合調(diào)控基因的表達(dá)。6.動物體內(nèi)實驗結(jié)果顯示miR-218-5p在體內(nèi)靶向抑制HMGB1的表達(dá)抑制裸鼠皮下膠質(zhì)瘤的生長。結(jié)論:miR-218-5p在膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)下調(diào),通過靶向調(diào)控HMGB1的表達(dá)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移,并誘導(dǎo)其凋亡。在體內(nèi)miR-218-5p靶向調(diào)控HMGB1抑制膠質(zhì)瘤生長。
【圖文】：

miR-218-5p 靶向調(diào)控 HMGB1蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 對膠質(zhì)瘤的抑制作用及機(jī)制研究進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，使用 GraphPad Prism 7 軟件作圖。數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示。兩組間差異比較用獨(dú)立樣本 t 檢驗，患者生存曲線使用 Kaplan-Meier 法繪制，使用對數(shù)秩檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析。P<0.05 表示存在統(tǒng)計學(xué)差異。1.4 實驗結(jié)果1.4.1 生物信息學(xué)篩選膠質(zhì)瘤中差異表達(dá) miRNA通過對 NCBI 膠質(zhì)瘤 GEO 數(shù)據(jù)分析，選取在正常腦組織及不同級別膠質(zhì)瘤中具有差異表達(dá)的 miRNA,進(jìn)行熱圖聚類后的結(jié)果如圖（圖 1-1）所示。結(jié)果顯示，miR-218-5p 在膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織中的表達(dá)具有明顯差異，在膠質(zhì)瘤組織中呈下調(diào)表達(dá)，并隨著膠質(zhì)瘤級別的增加其表達(dá)量逐漸減低。

圖 1-2 miR-218-5p 在正常腦組織和膠質(zhì)瘤中的表達(dá)1.4.3 miR-218-5p 的表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后相關(guān)對納入研究的 66 例患者進(jìn)行電話隨訪，術(shù)后隨訪時間在 9~69 個月之間，，平均隨訪時間（22.4±6.7 月）。通過繪制患者的生存曲線（Kaplan-Meier 法）顯示，miR-218-5p 低表達(dá)的患者的總生存期顯著低于高表達(dá)的患者。同樣，miR-218-5p低表達(dá)患者的無進(jìn)展生存期顯著低于高表達(dá)的患者。表明 miR-218-5p 在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后顯著相關(guān)（P <0.001；圖 1-3）。
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R739.41

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本文編號：2673557