【摘要】：帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,其病理特征為黑質(zhì)致密部(substantia nigra pars compacta,SNpc)多巴胺(dopamine,DA)能神經(jīng)元的漸進(jìn)性缺失及路易小體的形成,由此導(dǎo)致紋狀體(striatum,Str)DA含量的降低。盡管PD的病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,研究認(rèn)為包括氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、線粒體功能缺失和泛素蛋白酶體系統(tǒng)功能障礙等多種因素均參與了PD的發(fā)病。α-突觸核蛋白是PD特征性病理包涵體-路易小體的主要成分。越來越多的證據(jù)表明α-突觸核蛋白的異常表達(dá)和聚集在PD發(fā)病中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。因此,清除異常聚集的α-突觸核蛋白對于PD的治療具有重要意義。Ndfip1是一種跨膜蛋白,含有221個氨基酸殘基,結(jié)構(gòu)上含有兩個PPx Y基序,能夠與Nedd4泛素連接酶的WW結(jié)構(gòu)域結(jié)合,以介導(dǎo)泛素依賴性蛋白質(zhì)降解。Ndfip1作為某些蛋白質(zhì)泛素化過程的早期傳感器蛋白,通過與E3連接酶共同作用,清除神經(jīng)細(xì)胞中有害的錯誤折疊蛋白質(zhì),促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的存活,從而起到抗凋亡作用。研究表明Ndfip1在腦缺血和創(chuàng)傷性腦損傷后存活神經(jīng)元中均有高水平的表達(dá),同時伴隨其結(jié)合蛋白Nedd4表達(dá)水平增加,推測這兩種蛋白質(zhì)的高表達(dá)及相互作用可能有助于促進(jìn)損傷神經(jīng)細(xì)胞的存活。但是Ndfip1在PD中的神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制尚未完全闡明。因此,本實驗在人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞上應(yīng)用熒光實時定量PCR、免疫印跡、腺病毒技術(shù)及免疫熒光等方法研究了Ndfip1對線粒體復(fù)合物I抑制劑魚藤酮處理的SH-SY5Y細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)作用及可能的機(jī)制,并進(jìn)一步探討了Ndfip1對魚藤酮誘導(dǎo)的PD細(xì)胞模型中α-突觸核蛋白的蛋白水平的影響。實驗結(jié)果為揭示PD的發(fā)病機(jī)制和研制新一代治療藥物提供新的理論依據(jù)和治療靶點(diǎn)。結(jié)果:1、300 nmol/L魚藤酮處理SH-SY5Y細(xì)胞3 hrs、6 hrs、9 hrs、12 hrs、24 hrs后檢測α-突觸核蛋白的m RNA水平變化。結(jié)果表明,魚藤酮處理SH-SY5Y細(xì)胞12 hrs、24 hrs后α-突觸核蛋白的m RNA水平與對照組相比分別增強(qiáng)164.3%(P0.01),219.5%(P0.001),差異有顯著性。2、300 nmol/L魚藤酮處理SH-SY5Y細(xì)胞3 hrs、6 hrs、9 hrs、12 hrs、24 hrs后檢測α-突觸核蛋白的蛋白水平變化。結(jié)果表明,α-突觸核蛋白的表達(dá)水平于魚藤酮處理SH-SY5Y細(xì)胞6 hrs后開始增加;300 nmol/L魚藤酮處理SH-SY5Y細(xì)胞6 hrs、9 hrs、12 hrs、24 hrs后α-突觸核蛋白的表達(dá)水平與對照組相比,分別上調(diào)106.6%(P0.05),188.9%(P0.01),213.6%(P0.01),311.6%(P0.001),差異有顯著性。3、300 nmol/L魚藤酮處理SH-SY5Y細(xì)胞3 hrs、6 hrs、9 hrs、12 hrs、24 hrs后檢測Ndfip1的m RNA水平變化。結(jié)果表明,Ndfip1的m RNA水平于魚藤酮處理SH-SY5Y細(xì)胞6 hrs后開始增加;300 nmol/L魚藤酮處理SH-SY5Y細(xì)胞6 hrs、9 hrs后,Ndfip1的m RNA水平與對照組相比,分別上調(diào)83.7%(P0.05),69.6%(P0.05),差異有顯著性。4、300 nmol/L魚藤酮處理SH-SY5Y細(xì)胞3 hrs、6 hrs、9 hrs、12 hrs、24 hrs后檢測Ndfip1的蛋白水平變化。結(jié)果表明Ndfip1蛋白的表達(dá)水平于魚藤酮處理SH-SY5Y細(xì)胞3 hrs后開始增加;魚藤酮處理SH-SY5Y細(xì)胞3 hrs,6 hrs,9 hrs后,Ndfip1的蛋白水平與對照組相比,分別上調(diào)34.2%(P0.01),62.9%(P0.001),27.4%(P0.01),差異有顯著性。魚藤酮處理SH-SY5Y細(xì)胞24 hrs后Ndfip1蛋白的表達(dá)水平與對照組相比降低22.5%(P0.05),差異有顯著性。5、重組腺病毒感染SH-SY5Y細(xì)胞24 hrs后與魚藤酮共孵育24 hrs,魚藤酮處理組及Ad.GFP/魚藤酮組細(xì)胞中的TH蛋白的表達(dá)水平與對照組相比分別下調(diào)37.5%(P0.001)和44.2%(P0.001),差異有顯著性;Ad.Ndfip1/魚藤酮組細(xì)胞中的TH蛋白的表達(dá)水平與魚藤酮組相比上調(diào)37.7%(P0.01),差異有顯著性。6、重組腺病毒感染SH-SY5Y細(xì)胞24 hrs后與魚藤酮共孵育24 hrs,魚藤酮處理組及Ad.GFP/魚藤酮組細(xì)胞中的caspase-3蛋白的表達(dá)水平與對照組相比分別上調(diào)60.3%(P0.05)和75.4%(P0.01),差異有顯著性;Ad.Ndfip1/魚藤酮組細(xì)胞中的Caspase-3蛋白的表達(dá)水平與魚藤酮組相比下調(diào)29.0%(P0.05),差異有顯著性。7、重組腺病毒感染SH-SY5Y細(xì)胞24 hrs后與魚藤酮共孵育24 hrs,魚藤酮組及Ad.GFP/魚藤酮組細(xì)胞中的Ndfip1蛋白的表達(dá)水平與對照組相比分別下調(diào)35.5%(P0.05),49.5%(P0.01),差異有顯著性;Ad.Ndfip1/魚藤酮組細(xì)胞中的Ndfip1蛋白的表達(dá)水平與魚藤酮組和Ad.GFP/魚藤酮組分別相比上調(diào)130.2%(P0.001)和194.5%(P0.001),差異有顯著性。8、重組腺病毒感染SH-SY5Y細(xì)胞24 hrs后與魚藤酮共孵育24 hrs,魚藤酮組及Ad.GFP/魚藤酮組細(xì)胞中的α-突觸核蛋白的表達(dá)水平與對照組相比分別上調(diào)86.8%(P0.01)和88.7%(P0.01),差異有顯著性;Ad.Ndfip1/魚藤酮組細(xì)胞中的Ndfip1蛋白的表達(dá)水平與魚藤酮組和Ad.GFP/魚藤酮組相比分別下調(diào)31.9%(P0.05)和37.4%(P0.05),差異有顯著性;免疫熒光結(jié)果表明,魚藤酮處理細(xì)胞后細(xì)胞α-突觸核蛋白的表達(dá)明顯增加,Ad.Ndfip1感染的SH-SY5Y細(xì)胞中的α-突觸核蛋白的蛋白水平明顯降低。結(jié)論:魚藤酮誘導(dǎo)的PD細(xì)胞模型中Ndfip1的表達(dá)減少伴隨著α-突觸核蛋白的表達(dá)增加,且高表達(dá)Ndfip1能夠抑制由魚藤酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化,caspase-3蛋白的表達(dá)增加,TH蛋白表達(dá)減少及α-突觸核蛋白表達(dá)的上調(diào)。提示Ndfip1對魚藤酮誘導(dǎo)的PD模型具有保護(hù)作用。本實驗所研究的Ndfip1對魚藤酮誘導(dǎo)的PD細(xì)胞模型的保護(hù)作用及其可能機(jī)制的探討,為進(jìn)一步深入探討緩解PD發(fā)病過程中α-突觸核蛋白異常聚集所致的神經(jīng)毒性及干預(yù)措施,提供了新的實驗依據(jù)。
【圖文】：

結(jié)果結(jié) 果1. 魚藤酮上調(diào) SH-SY5Y 細(xì)胞中α-突觸核蛋白的表達(dá)我們使用 300 nmol/L 魚藤酮對 SH-SY5Y 細(xì)胞進(jìn)行處理后，應(yīng)用實時定量 PCR 和免疫印跡的方法分別檢測了α-突觸核蛋白的 mRNA 及蛋白水平隨時間的變化情況。結(jié)果顯示，與對照組相比，在魚藤酮處理 SH-SY5Y 細(xì)胞 12 hrs 和 24 hrs 后可顯著增加α-突觸核蛋白的 mRNA 表達(dá)水平（圖 1A）。免疫印跡法檢測結(jié)果表明，，與對照組相比，魚藤酮處理 SH-SY5Y 細(xì)胞 6 hrs 后，α-突觸核蛋白的蛋白表達(dá)開始上調(diào)，魚藤酮處理SH-SY5Y 細(xì)胞 9 hrs，12 hrs 和 24 hrs 后，α-突觸核蛋白的蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步增加（圖1B），差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。

青島大學(xué)碩士學(xué)位論文2. 魚藤酮處理的 SH-SY5Y 細(xì)胞 Ndfip1 的表達(dá)變化為了研究魚藤酮處理是否會影響 Ndfip1 的表達(dá)，我們檢測了 Ndfip1 在 mRNA 和蛋白質(zhì)水平上隨時間的表化情況。結(jié)果顯示，魚藤酮處理后，在 6 hrs 和 9 hrs 時 Ndfip1的 mRNA 水平表達(dá)增加（圖 2A），與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。同時，我們還通過免疫印跡法檢測了魚藤酮處理的 SH-SY5Y 細(xì)胞中 Ndfip1 的蛋白水平。結(jié)果顯示，魚藤酮處理 SH-SY5Y 細(xì)胞 3 hrs，6 hrs，9 hrs 后，Ndfip1 的蛋白水平與對照相比明顯增加；而在魚藤酮處理 SH-SY5Y 細(xì)胞 24 hrs 后，Ndfip1 的蛋白表達(dá)與對照相比降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖 2B）。
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R742.5

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本文編號：2673367