【摘要】：中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后如何修復(fù)一直備受關(guān)注。近年來,文獻(xiàn)報(bào)道神經(jīng)元軸突的再生能力是影響神經(jīng)元損傷修復(fù)的關(guān)鍵因素之一。研究結(jié)果證實(shí),抑制PTEN基因激活m TOR的活性,能促進(jìn)損傷神經(jīng)元軸突的再生。因此,如何沉默PTEN激活m TOR就顯得尤為重要。本文通過合成PTEN降解短肽,利用在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)TAT-PDZ-CTM蛋白質(zhì),通過不同的層析原理進(jìn)行純化,篩選出獲得高純度蛋白的純化條件,為后續(xù)進(jìn)一步應(yīng)用靶向PTEN降解蛋白,激活m TOR通路,研究損傷神經(jīng)元軸突的再生機(jī)制提供高純度的蛋白質(zhì)。方法:1.利用分子生物學(xué)的方法構(gòu)建TAT-PDZ-CTM序列。2.利用原核表達(dá)系統(tǒng)(大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞)表達(dá)蛋白TAT-PDZ-CTM,在IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的作用下,成功表達(dá)出高含量的蛋白。利用SDS-PAGE,Western blot方法檢測(cè),確定表達(dá)的蛋白是否正確。3.通過比較兩種純化方法,分別是純化方法一:S75凝膠層析-超濾除鹽及純化方法二:復(fù)合陽離子層析-G-25凝膠除鹽處理蛋白質(zhì),最后通過SDS-PAGE,HPLC檢測(cè)方法鑒定純化后樣品純度,并最終確定合適的純化方法。4.通過TAT-PDZ-CTM作用類神經(jīng)元細(xì)胞SH-SY5Y實(shí)驗(yàn),利用Western blot方法檢測(cè)胞內(nèi)PTEN的表達(dá)情況,驗(yàn)證TAT-PDZ-CTM的活性。結(jié)果:1.成功構(gòu)建出重組的表達(dá)載體p ET28a-TAT-PDZ-CTM。2.通過大腸桿菌的表達(dá)系統(tǒng),利用IPTG誘導(dǎo)促進(jìn)表達(dá)作用,表達(dá)出目的蛋白TAT-PDZ-CTM。3.針對(duì)序列設(shè)計(jì)時(shí)N端含有的6*His標(biāo)簽,特定的選擇親和層析純化,有效地提純蛋白質(zhì)。4.通過純化方法一:Ni親和層析-S75凝膠層析-超濾除鹽,獲得的蛋白質(zhì)純度為94.31%,含量為0.27mg/ml;通過純化方法二:Ni親和層析-復(fù)合陽離子層析-G25凝膠除鹽,獲得的蛋白質(zhì)純度為98.57%,含量為1.20mg/ml。5.在正常細(xì)胞SY5Y中,按比例加入35μg/ml TAT-PDZ-CTM,通過Western Blot鑒定細(xì)胞內(nèi)的PTEN被有效降解。結(jié)論:1.通過比較兩種純化方法,確定純化方法二:復(fù)合陽離子層析-G25凝膠除鹽方法及條件比純化方法一:S75凝膠層析-超濾除鹽方法及條件純化蛋白TAT-PDZ-CTM,獲得的最終樣品純度及含量更高,因此純化方法二的層析步驟更適用于TAT-PDZ-CTM的純化。2.成功表達(dá)出降解細(xì)胞內(nèi)源蛋白PTEN的短肽TAT-PDZ-CTM。
【圖文】：

圖 3.1 TAT-PDZ-CTM 提取質(zhì)粒電泳圖帶依次順序?yàn)?M：Marker IV，1：質(zhì)粒 TAT-PDZ-CTM-CTM 質(zhì)粒的堿基序列鑒定結(jié)果（圖 3.2）：圖 3.2 TAT-PDZ-CTM 質(zhì)粒序列比對(duì)

1 質(zhì)粒提取后的鑒定結(jié)果1）按照質(zhì)粒提取的操作步驟提取 pET28a-TAT-PDZ-CTM 質(zhì)粒進(jìn)行 1%糖電泳鑒定結(jié)果如下（圖 3.1）：圖 3.1 TAT-PDZ-CTM 提取質(zhì)粒電泳圖圖注：條帶依次順序?yàn)?M：Marker IV，，1：質(zhì)粒 TAT-PDZ-CTM2）TAT-PDZ-CTM 質(zhì)粒的堿基序列鑒定結(jié)果（圖 3.2）：
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R741

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本文編號(hào)：2671889