【摘要】：背景和目的缺血性腦卒中(Ischemic stroke)是由腦動脈阻塞和血流灌注不足所引起的缺血性卒中,缺血性腦卒中占總腦卒中病例的87%。缺血再灌注損傷是在恢復(fù)或重新獲得血液供應(yīng)后的組織細(xì)胞內(nèi)造成的損傷。造成缺血性損傷的原因,如炎癥反應(yīng)應(yīng)答、興奮性中毒、Ca~(2+)和Zn~(2+)的過載、擴(kuò)散性去極化和游離自由基的產(chǎn)生,這些原因會造成不良后果,如由內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成的血腦屏障的破壞、免疫細(xì)胞的侵潤和神經(jīng)元的凋亡等。炎癥應(yīng)答是發(fā)生在腦損傷后的主要事件,它既可以擴(kuò)大缺血性腦損傷又可以幫助促進(jìn)損傷的恢復(fù)。在炎癥反應(yīng)的早期,釋放的促炎癥因子和有害的自由基能加速細(xì)胞的損傷。腦缺血再灌注損傷階段,由于腦損傷產(chǎn)生的促炎癥因子可以使循環(huán)血中的免疫細(xì)胞、病原體和毒素等滲透入腦實(shí)質(zhì),造成二次損傷級聯(lián)反應(yīng),如神經(jīng)元的凋亡等。血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)是一個(gè)高度特化的神經(jīng)血管結(jié)構(gòu)單元,由腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞等一起相互協(xié)調(diào)作用,構(gòu)成調(diào)節(jié)血液中物質(zhì)進(jìn)出腦內(nèi)的屏障結(jié)構(gòu),并能保持腦內(nèi)微環(huán)境穩(wěn)態(tài)。有文獻(xiàn)報(bào)道血腦屏障的破裂很可能是腦卒中的腦實(shí)質(zhì)損傷的一個(gè)原因。隨著細(xì)胞自噬過程的發(fā)現(xiàn)和研究進(jìn)展,自噬相關(guān)蛋白(Autophagy related protein)Atg7的重要作用得到了人們的廣泛關(guān)注。Atg7在自噬和非自噬過程中都發(fā)揮了重要的作用。Atg7(E1-like activating enzyme)是巨自噬泛素系統(tǒng)中的核心蛋白,因此Atg7一直是研究的熱點(diǎn)。為了揭示Atg7的功能,多種不同組織Atg7的條件性敲除小鼠被廣泛研究。例如,體外自噬的抑制或Atg5/Atg7的干擾抑制體外VWF的分泌。使用VE-cadherin-Cre工具在內(nèi)皮細(xì)胞中敲除Atg7可以減少VWF的釋放,減少高分子量VWF多聚體的水平和出血時(shí)間,從而減少和改善血栓的形成。內(nèi)皮細(xì)胞敲除Atg7可以促使體內(nèi)博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化,說明完整的內(nèi)皮細(xì)胞的自噬可以防止異常的EMT并限制器官的纖維化。在本實(shí)驗(yàn)室的前期研究中,在腦血管生成中,內(nèi)皮細(xì)胞敲除Atg7能減少小鼠腦血管的密度。體外實(shí)驗(yàn)中,Atg7的表達(dá)降低也損傷了血管生成。進(jìn)一步的研究表明Atg7能通過減少IL-6的表達(dá)來使血管生成減少,而VEGF的表達(dá)不受Atg7的影響。這些結(jié)果都說明Atg7具有促血管生成的作用。腦組織對缺血、缺氧非常敏感。如何保護(hù)缺血再灌注時(shí)腦細(xì)胞的功能,長期以來一直是腦血管疾病研究的熱點(diǎn)。本研究論文主要討論內(nèi)皮細(xì)胞Atg7的敲除在腦缺血再灌注損傷中的作用和機(jī)制。研究方法一、腦內(nèi)皮細(xì)胞中Atg7的敲除導(dǎo)致缺血再灌注小鼠的腦梗死體積減小及神經(jīng)缺陷的改善組織免疫熒光-冰凍切片法檢測內(nèi)皮細(xì)胞Atg7敲除小鼠和WT小鼠腦組織中Atg7的表達(dá)。用短暫局灶性腦缺血模型(tFCI模型),檢測內(nèi)皮細(xì)胞Atg7的敲除對腦缺血再灌注損傷是否具有抵抗性。用神經(jīng)功能缺陷評分法和運(yùn)動功能損傷實(shí)驗(yàn)檢測腦缺血再灌注損傷對Atg7eKO小鼠和WT小鼠的不同影響。二、Atg7 eKO小鼠顯示出神經(jīng)元凋亡減少及中性粒細(xì)胞侵潤減少用TUNEL細(xì)胞凋亡法檢測Atg7 eKO小鼠和WT小鼠腦冠狀切片中的凋亡細(xì)胞數(shù)量。用Ly6B.2抗體組織免疫熒光染色檢測Atg7 eKO小鼠和WT小鼠腦冠狀切片中侵潤的中性粒細(xì)胞數(shù)量。三、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,內(nèi)皮細(xì)胞中Atg7的敲除導(dǎo)致腦紋狀體和皮層中的促炎癥因子(IL-6,IL-1β,IL-8和TNF-α)的表達(dá)降低當(dāng)發(fā)生短暫性腦缺血再灌注損傷后,制備Atg7 eKO小鼠和WT小鼠的兩側(cè)腦紋狀體或皮層蛋白勻漿液,用ELISA檢測促炎癥細(xì)胞因子IL-6,IL-1β,IL-8和TNF-α的蛋白表達(dá)。發(fā)生腦中動脈栓塞1小時(shí)后,當(dāng)再灌注時(shí)間達(dá)到24小時(shí)時(shí),分別提取Atg7 eKO小鼠和WT小鼠兩側(cè)腦紋狀體及皮層的總RNA,用Real-time PCR檢測促炎癥因子IL-6,IL-1β,IL-8和TNF-α的mRNA水平。四、在人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中,Atg7的表達(dá)降低能使促炎癥因子(IL-6,IL-1β,IL-8和TNF-α)的表達(dá)降低用人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞,構(gòu)建Atg7穩(wěn)定干擾細(xì)胞株(Atg7 shRNA)和對照細(xì)胞株(Non-silencing shRNA)。建立氧糖剝奪再復(fù)氧細(xì)胞模型模擬在體腦缺血再灌注損傷模型。以常氧培養(yǎng)為對照,用ELISA法檢測OGD/R時(shí)Atg7穩(wěn)定干擾細(xì)胞株和對照細(xì)胞株分泌或胞內(nèi)的IL-6,IL-1β,IL-8和TNF-α的蛋白水平。以常氧條件為對照,用Real-time PCR法檢測OGD/R時(shí)Atg7 shRNA和non-silencing shRNA細(xì)胞株的IL-6,IL-1β,IL-8和TNF-αmRNA表達(dá)水平。五、常氧和缺氧時(shí),Atg7通過NF-κB信號通路調(diào)控腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中促炎癥因子(IL-6,IL-1β,IL-8和TNF-α)的產(chǎn)生,而不通過轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α通路以常氧為對照,用WB檢測OGD/R時(shí)Atg7的表達(dá)降低是否能導(dǎo)致NF-κB上游抑制因子IKKβ和IκBα的磷酸化水平降低。以常氧為對照,用WB和細(xì)胞免疫熒光檢測OGD/R時(shí)Atg7的下調(diào)能否使NF-κB的功能亞單位p65(Rel A)入核減少。使用NF-κB激活劑Betulinic acid刺激HBMECs 24小時(shí),Real-time PCR檢測IL-6,IL-1β,IL-8和TNF-αmRNA表達(dá)是否有補(bǔ)償性地升高。常氧和缺氧發(fā)生時(shí),用WB和細(xì)胞免疫熒光檢測Atg7 shRNA和non-silencing shRNA細(xì)胞株的轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α表達(dá)。六、Atg7通過NF-κB信號通路轉(zhuǎn)錄上調(diào)促炎癥因子的表達(dá)是特異的使用小干擾RNA瞬時(shí)干擾Atg7時(shí),ELISA和Real-time PCR檢測IL-6,IL-1β,IL-8和TNF-α的蛋白和mRNA水平如何變化。瞬時(shí)干擾Atg7時(shí),ChIP檢測轉(zhuǎn)錄因子p65與IL-6,IL-1β,IL-8和TNF-α啟動子區(qū)DNA的結(jié)合。檢測當(dāng)3-MA和chloroquine影響自噬通路時(shí),促炎癥因子IL-6,IL-1β,IL-8和TNF-α的mRNA表達(dá)如何變化。七、Atg7以NF-κB依賴方式調(diào)控腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中促炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生的工作模式圖用信號通路繪制軟件繪制工作模式圖。結(jié)果一、內(nèi)皮細(xì)胞Atg7的敲除導(dǎo)致腦缺血再灌注小鼠的梗死體積減小及神經(jīng)缺陷的改善血管內(nèi)皮細(xì)胞Atg7敲除的小鼠的內(nèi)皮細(xì)胞不表達(dá)Atg7,而WT小鼠的內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)Atg7。腦缺血再灌注損傷后,Atg7 eKO小鼠比WT小鼠的腦梗死體積減小。腦缺血再灌注損傷后,Atg7 eKO小鼠表現(xiàn)為運(yùn)動功能損傷更輕。二、Atg7 eKO小鼠顯示出神經(jīng)元凋亡減少及中性粒細(xì)胞的侵潤減少與WT小鼠相比,腦缺血再灌注損傷發(fā)生后,Atg7 eKO小鼠的腦皮層中TUNEL陽性神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)量顯著減少。與WT小鼠相比,腦缺血再灌注損傷發(fā)生后,Atg7 eKO小鼠的腦皮層中Ly6B.2陽性中性粒細(xì)胞的數(shù)目顯著減少。三、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,內(nèi)皮細(xì)胞Atg7的敲除導(dǎo)致腦紋狀體和皮層中促炎癥因子的表達(dá)降低腦缺血再灌注損傷后,Atg7 eKO小鼠手術(shù)側(cè)腦紋狀體或皮層中的促炎癥因子IL-6,IL-1β,IL-8和TNF-α的表達(dá)比WT小鼠更低。腦缺血再灌注損傷后,除IL-8/CXCL-15外,Atg7 eKO小鼠手術(shù)側(cè)腦紋狀體或皮層中促炎癥因子IL-6,IL-1β和TNF-α的mRNA相對表達(dá)水平也低于WT小鼠。四、人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中,Atg7的表達(dá)降低能使促炎癥因子的表達(dá)降低確定人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中Atg7的干擾效率。無論常氧或缺氧,在人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中,Atg7的表達(dá)降低能使促炎癥細(xì)胞因子IL-6,IL-1β,IL-8和TNF-α的分泌或胞內(nèi)表達(dá)降低。無論常氧或缺氧,干擾Atg7的表達(dá),HBMECs中促炎癥因子IL-6,IL-1β,IL-8和TNF-α的mRNA相對表達(dá)水平也降低。五、常氧和缺氧時(shí),Atg7通過NF-κB信號通路調(diào)控腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中促炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生,而不通過轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α通路在常氧和OGD4hr/R24hr時(shí),干擾Atg7的表達(dá)導(dǎo)致NF-κB上游抑制因子IKKβ和IκBα的磷酸化水平降低。同時(shí),干擾Atg7的表達(dá)導(dǎo)致NF-κB的亞單位p65入核減少。NF-κB信號通路激活劑Betulinic acid能使促炎癥因子IL-1β,IL-6和IL-8 mRNA相對表達(dá)升高,但對TNF-α的表達(dá)無影響。在常氧和OGD4hr/R24hr時(shí),干擾Atg7導(dǎo)致促炎癥因子表達(dá)下降與轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α的表達(dá)無關(guān)。六、Atg7通過NF-κB信號通路轉(zhuǎn)錄上調(diào)促炎癥因子的表達(dá)是特異的瞬時(shí)干擾Atg7可以模擬穩(wěn)定干擾Atg7對促炎癥因子IL-1β,IL-6,IL-8和TNF-α的作用。轉(zhuǎn)錄因子p65對促炎癥因子啟動子的結(jié)合用ChIP進(jìn)一步證明上述結(jié)果。自噬抑制劑3-MA和Chloroquine不能改變促炎癥因子IL-1β,IL-8和TNF-α的mRNA表達(dá),但可以使IL-6 mRNA表達(dá)升高。七、Atg7以NF-κB依賴方式調(diào)控腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中促炎癥因子的產(chǎn)生的工作模式圖在腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中,當(dāng)缺血(糖)缺氧發(fā)生時(shí),Atg7能通過NF-κB信號通路調(diào)控促炎癥因子IL-6,IL-1β,IL-8和TNF-α的表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞凋亡和中性粒細(xì)胞的募集和侵潤。結(jié)論在短暫性腦缺血導(dǎo)致腦再灌注損傷發(fā)生后,Atg7 eKO小鼠表現(xiàn)為對腦損傷更有抵抗性。當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞缺乏Atg7時(shí),小鼠在MCAO后的運(yùn)動功能缺陷水平更低;腦損傷的梗死區(qū)域減小;腦皮層區(qū)的TUNEL陽性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量更少,且有更少數(shù)量的Ly6B.2~+中性粒細(xì)胞侵潤到腦實(shí)質(zhì)中。體外實(shí)驗(yàn),HBMECs中,Atg7的表達(dá)降低影響炎癥因子的變化與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)基本一致;Atg7調(diào)控促炎癥因子的變化是通過IKKβ-IκBα-NF-κB-p65信號通路的,與HIF-1α無關(guān);Atg7調(diào)控NF-κB信號的特異性不能被自噬抑制劑所模擬。
【圖文】：

中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 驗(yàn)證小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞 Atg7 的敲除效應(yīng)使用 Atg7 基因兩側(cè)有 Lox P 的小鼠與表達(dá) Cre 重組酶（在 VE-cadherin 啟動控下）的小鼠雜交，產(chǎn)生內(nèi)皮細(xì)胞特異性敲除 Atg7 基因的小鼠（Atg7 eKO織免疫熒光檢測小鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中 Atg7 的分布，在 WT 同窩對照小鼠中7 主要分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞和腦內(nèi)其他細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，而在 Atg7 eKO 小鼠7 并不分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞中，但可見分布于其他細(xì)胞的胞質(zhì)中且 Atg7 與 CD的血管內(nèi)皮細(xì)胞沒有共定位，而在其他細(xì)胞的胞質(zhì)中可見 Atg7 染色。

圖 2：用 PCR 和 2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定 WT 和 Atg7 eKO 小鼠的基因型。.3 腦內(nèi)皮細(xì)胞中 Atg7 的敲除可以減少腦缺血再灌注造成的損傷為了檢驗(yàn)小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞中 Atg7 的敲除對小鼠腦神經(jīng)損傷的影響，我們將T 和 Atg7 eKO 小鼠進(jìn)行了腦缺血 1 小時(shí)/再灌注 24 小時(shí)的 I/R 模型。Atg7 eKO 小表現(xiàn)為腦缺血再灌注后腦損傷的體積減少和神經(jīng)功能缺陷的降低（Longa 5 分法）。灌注 24 小時(shí)后，先對小鼠進(jìn)行神經(jīng)和運(yùn)動功能的檢測，隨后取腦，2% TTC 染色，測腦梗死區(qū)域體積的大小。
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R743.3

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 童亞男;查麗;;五參口服液對糖尿病合并冠心病患者內(nèi)皮功能的影響[J];現(xiàn)代養(yǎng)生;2016年22期

2 劉慧敏;耿靜;王世君;張瑞;吳平;;狼瘡性腎炎患者內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體表達(dá)的研究[J];中國皮膚性病學(xué)雜志;2007年02期

3 王妍;陶軍;楊震;涂昌;徐明國;王潔梅;黃奕俊;;腫瘤壞死因子促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞微顆粒釋放的實(shí)驗(yàn)研究[J];中華心血管病雜志;2005年12期

4 孫麗莎;內(nèi)皮細(xì)胞與缺血性腦血管疾病[J];微循環(huán)學(xué)雜志;2002年03期

5 吳榮謙,孟憲鈞;內(nèi)皮細(xì)胞與多器官功能失常綜合征[J];中華實(shí)驗(yàn)外科雜志;1999年01期

6 ;人巨細(xì)胞病毒感染誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞纖溶酶原激活劑抑制物1mRNA的表達(dá)及分泌[J];國外醫(yī)學(xué).病毒學(xué)分冊;1999年04期

7 夏豪,李庚山,尹麗婭,李曉艷,王晶;血小板源性生長因子對于培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子水平的影響(摘要)[J];湖北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);1999年02期

8 何澤涌;;關(guān)于內(nèi)皮細(xì)胞研究的某些進(jìn)展[J];山西醫(yī)藥雜志;1987年03期

9 何澤涌;;關(guān)于內(nèi)皮細(xì)胞研究的某些進(jìn)展[J];山西醫(yī)藥雜志;1987年04期

10 何澤涌;;關(guān)于內(nèi)皮細(xì)胞研究的某些進(jìn)展[J];山西醫(yī)藥雜志;1987年05期

相關(guān)會議論文 前10條

1 應(yīng)大君;陳衛(wèi)軍;周丁華;;內(nèi)皮細(xì)胞機(jī)械感受功能的實(shí)驗(yàn)研究[A];面向21世紀(jì)的科技進(jìn)步與社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展（下冊）[C];1999年

2 林萍章;PualJ.Pearson;RaymondCartier;KazuhiroHashimoto;HartzellV.Schaff;;內(nèi)膜再生過程中,內(nèi)皮細(xì)胞之反應(yīng)[A];海峽兩岸電子顯微學(xué)討論會論文專集[C];1991年

3 熊建瓊;朱佩芳;王正國;蔣建新;;髓樣分化蛋白-2在內(nèi)毒素與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合中的作用[A];第十一次全國急診醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會議暨中華醫(yī)學(xué)會急診醫(yī)學(xué)分會成立二十周年慶典論文匯編[C];2006年

4 俞松;曹江;;重組人血管內(nèi)皮抑制素對血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞作用的實(shí)驗(yàn)研究[A];第八屆全國兒童腫瘤學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2009年

5 鄧紅;李懿萍;來茂德;;高糖環(huán)境細(xì)胞間相互作用對內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生活性氧和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子的影響[A];中華醫(yī)學(xué)會病理學(xué)分會2005年學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2005年

6 田，

本文編號：2667840