【摘要】：目的通過線栓法制備SD大鼠大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)缺血再灌注模型,觀察葉酸缺乏(folic acid deficiency,FD)對腦缺血再灌注后大腦線粒體損傷的影響,通過葉酸缺乏和JAK2/STAT3抑制劑AG490聯(lián)合干預,探討線粒體內信號轉導及轉錄激活子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)在葉酸缺乏引起的腦缺血再灌注損傷中的作用。體外培養(yǎng)N2a細胞,建立氧糖剝奪/復氧(oxygen and glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)模型,檢測葉酸缺乏對N2a細胞活力的影響,不同通路的抑制劑分別與葉酸缺乏聯(lián)合干預,探討葉酸缺乏對N2a細胞線粒體內STAT3不同活化位點的具體調控機制,為腦梗塞疾病的預防及治療提供新的思路及實驗依據(jù)。方法1.125只體重為160-180 g的雄性SD大鼠,采用隨機數(shù)字表法分為5組,分別為假手術組(SHAM)、大腦中動脈缺血再灌注模型組(MCAO)、模型+葉酸缺乏組(MCAO+FD)、模型+葉酸缺乏+AG490組(MCAO+FD+AG490)及模型+AG490組(MCAO+AG490),每組25只。SHAM、MCAO組、MCAO+AG490組大鼠用正常對照飼料飼養(yǎng),MCAO+FD和MCAO+FD+AG490組大鼠用葉酸缺乏飼料飼養(yǎng),MCAO模型前,葉酸缺乏預干預25 d。MCAO+FD+AG490和MCAO+AG490組在手術前1 h以4 m L/kg·d劑量進行腹腔注射濃度為0.75 mg/m L的AG490溶液。造模后24 h通過TTC染色法測定大鼠腦梗死體積;FJB染色法檢測大鼠腦組織皮質區(qū)神經細胞損傷情況;透射電鏡觀察大腦線粒體損傷情況;免疫熒光雙標法檢測腦組織線粒體內p Y-STAT3和p S-STAT3表達情況;蛋白免疫印跡檢測腦組織中線粒體中p Y-STAT3、p S-STAT3、JAK2、p-JAK2蛋白表達。2.體外培養(yǎng)N2a細胞,建立細胞OGD/R模型,分別用AG490、LY294002、U0126抑制劑與葉酸缺乏聯(lián)合干預,CCK-8檢測細胞活力,Western blot檢測線粒體中p Y-STAT3、p S-STAT3、p-ERK1/2、p-AKT、p-JNK、JNK的表達情況。結果1.與MCAO組比較,葉酸缺乏干預組:TTC染色法結果顯示腦梗死體積增大;FJB染色法結果顯示神經細胞損傷明顯加重;透射電鏡觀察及線粒體損傷評分結果顯示,線粒體嚴重損傷;免疫熒光檢測結果顯示,大腦海馬皮質線粒體標記物COX IV與p Y-STAT3、COX IV與p S-STAT3雙陽性細胞數(shù)均進一步增加;Western blot檢測結果顯示,腦組織線粒體中p Y-STAT3、p S-STAT3、p-JAK2蛋白表達均升高,以上各個指標兩組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。與MCAO+FD組比較,MCAO+FD+AG490組:神經細胞損傷減輕;腦組織線粒體損傷減輕;免疫熒光檢測結果顯示,大腦皮質區(qū)線粒體COX IV與p Y-STAT3雙陽性細胞數(shù)較少;Western blot檢測結果顯示,腦組織中線粒體中p Y-STAT3、p-JAK2表達降低,以上各個指標的兩組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。p S-STAT3蛋白表達量無明顯改變(P0.05)。2.體外培養(yǎng)N2a細胞,建立細胞OGD/R模型,Western blot檢測結果顯示,細胞復氧30 min時,N2a細胞線粒體中p Y-STAT3蛋白表達量達到高峰;細胞復氧45 min時,p S-STAT3蛋白表達量達到高峰。分別用AG490、LY294002、U0126與葉酸缺乏聯(lián)合干預細胞,Western blot檢測結果顯示,與對照組比,OGD/R組細胞線粒體中的p Y-STAT3、p S-STAT3、p-ERK1/2、p-AKT表達量增加,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05),而p-JNK蛋白無明顯變化(P0.05)。與OGD/R組比較,OGD/R+FD組細胞線粒體中的p Y-STAT3、p S-STAT3、p-ERK1/2、p-AKT表達量進一步增加,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05),p-JNK蛋白無明顯變化(P0.05)。與OGD/R+FD相比,OGD/R+FD+AG490組p Y-STAT3蛋白表達量下降,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05),p S-STAT3蛋白表達量無明顯變化(P0.05);OGD/R+FD+LY294002組、OGD/R+FD+U0126組p S-STAT3蛋白表達水平下降,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05),p Y-STAT3蛋白表達量無明顯變化(P0.05)。CCK-8結果顯示:與對照組相比,OGD/R組細胞活力下降,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。與OGD/R組相比,OGD/R+FD組細胞活力進一步下降,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);與OGD/R+FD組相比,OGD/R+FD+AG490組、OGD/R+FD+LY294002組、OGD/R+FD+U0126組細胞活力均上升,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論建立大鼠腦缺血再灌注模型,發(fā)現(xiàn)葉酸缺乏增加了腦缺血再灌注后腦梗死面積、神經細胞凋亡及線粒體損傷,上調腦組織線粒體中p Y-STAT3、p S-STAT3 p-JAK2的表達,給予JAK2/STAT3通路抑制劑AG490后,葉酸缺乏引起的上述效應除p S-STAT3的表達量無明顯改變外,其余均在一定程度上被抑制。說明葉酸缺乏可能部分通過JAK2/STAT3通路上調線粒體中p Y-STAT3加劇大腦缺血后腦組織及線粒體損傷,葉酸缺乏對p S-STAT3的表達調控可能與JAK2/STAT3通路的激活無關。體外實驗成功建立N2a細胞OGD/R模型。葉酸缺乏干預后,上調細胞線粒體中p Y-STAT3、p S-STAT3、p-ERK1/2、p-AKT,細胞活力顯著下降。給予AG490抑制劑后,細胞活力升高,p Y-STAT3的表達量下降,p S-STAT3的表達量無明顯改變,與體內結果一致。給予LY294002或U0126抑制劑后,細胞活力均升高,p S-STAT3表達量下降,p-ERK1/2或p-AKT的表達量下調,p Y-STAT3的表達量無明顯改變,提示葉酸缺乏對線粒體p S-STAT3的調控可能與PI3K-AKT、MAPK/ERK1/2兩條通路有關,且對p Y-STAT3的調控獨立于這兩條通路。p-JNK蛋白無明顯改變,提示JNK通路可能未參與到STAT3的活化過程。綜上兩部分結果,我們得出結論:葉酸缺乏可以通過JAK2/STAT3通路上調線粒體中p Y-STAT3,通過PI3K/AKT、MAPK/ERK1/2通路上調線粒體中p S-STAT3,以上通路協(xié)同作用下加劇了腦缺血后腦組織神經細胞及線粒體損傷。
【圖文】：

1 葉酸缺乏對腦梗死大鼠梗死灶體積百分比的影響。A：各組大鼠腦組織 TTC 染色圖。組大鼠梗死灶體積統(tǒng)計分析。*：與 SHAM 組比較，#：與 MCAO 組比較，P<0.05.2.3 葉酸缺乏對腦缺血再灌注后大鼠腦組織神經細胞損傷的影響大鼠腦組織切片經 FJB 染色，倒置熒光顯微鏡下觀察大腦皮質區(qū)缺血半附近陽性細胞數(shù)，結果顯示：SHAM 組大腦皮質區(qū)陽性細胞數(shù)很少，MCA、MCAO+FD 組均可見數(shù)量不等的陽性細胞，見圖 2A。與 SHAM 組比較CAO 組陽性細胞數(shù)顯著增多，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與 MCAO 比，MCAO+FD 組陽性細胞數(shù)進一步增多，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）圖 2B。

15圖 2 葉酸缺乏對腦梗死大鼠腦組織神經細胞損傷的影響。A：各組大鼠 FJB 染色結果（FJB綠色、DAPI 藍色、MERGE 為二者合圖）；B： FJB/DAPI 雙標陽性細胞統(tǒng)計分析，*：與SHAM 組比較，#：與 MCAO 組比較，P<0.05，標尺=50 μm，放大倍數(shù)=10×201.2.4 葉酸缺乏對缺血再灌大鼠腦組織線粒體超微結構的影響為了檢測葉酸缺乏對神經系統(tǒng)線粒體的影響，在電鏡下對葉酸缺乏干預后腦缺血再灌注后大鼠皮質區(qū)線粒體形態(tài)變化進行觀察。結果如圖3A所示，SHAM組皮質區(qū)的神經元細胞，，細胞形態(tài)正常，核膜完整，各個細胞器未見腫脹或消失。線粒體形態(tài)正常，雙層膜完整，嵴排列規(guī)整。與 SHAM 組相比，腦缺血再灌 24 h 后，MCAO 組神經元細胞部分線粒體發(fā)生腫脹，雙層膜不完整，嵴排列紊亂甚至斷裂，個別線粒體出現(xiàn)空泡化，少數(shù)線粒體保持完整結構，其他細胞器部分發(fā)生腫脹。與 MCAO 組相比，MCAO+FD 組神經元細胞損傷最為明顯，
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R743.3

【參考文獻】

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1 王若禺;羅麗麗;周邦健;帕孜麗亞艾尼;彭耀軍;張?zhí)K明;;葉酸在大鼠急性腦梗死的缺血再灌注中可能起保護作用[J];南方醫(yī)科大學學報;2013年09期

本文編號：2666527