【摘要】：目的通過線栓法制備SD大鼠大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)缺血再灌注模型,觀察葉酸缺乏(folic acid deficiency,FD)對腦缺血再灌注后大腦線粒體損傷的影響,通過葉酸缺乏和JAK2/STAT3抑制劑AG490聯(lián)合干預(yù),探討線粒體內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)在葉酸缺乏引起的腦缺血再灌注損傷中的作用。體外培養(yǎng)N2a細(xì)胞,建立氧糖剝奪/復(fù)氧(oxygen and glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)模型,檢測葉酸缺乏對N2a細(xì)胞活力的影響,不同通路的抑制劑分別與葉酸缺乏聯(lián)合干預(yù),探討葉酸缺乏對N2a細(xì)胞線粒體內(nèi)STAT3不同活化位點的具體調(diào)控機(jī)制,為腦梗塞疾病的預(yù)防及治療提供新的思路及實驗依據(jù)。方法1.125只體重為160-180 g的雄性SD大鼠,采用隨機(jī)數(shù)字表法分為5組,分別為假手術(shù)組(SHAM)、大腦中動脈缺血再灌注模型組(MCAO)、模型+葉酸缺乏組(MCAO+FD)、模型+葉酸缺乏+AG490組(MCAO+FD+AG490)及模型+AG490組(MCAO+AG490),每組25只。SHAM、MCAO組、MCAO+AG490組大鼠用正常對照飼料飼養(yǎng),MCAO+FD和MCAO+FD+AG490組大鼠用葉酸缺乏飼料飼養(yǎng),MCAO模型前,葉酸缺乏預(yù)干預(yù)25 d。MCAO+FD+AG490和MCAO+AG490組在手術(shù)前1 h以4 m L/kg·d劑量進(jìn)行腹腔注射濃度為0.75 mg/m L的AG490溶液。造模后24 h通過TTC染色法測定大鼠腦梗死體積;FJB染色法檢測大鼠腦組織皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細(xì)胞損傷情況;透射電鏡觀察大腦線粒體損傷情況;免疫熒光雙標(biāo)法檢測腦組織線粒體內(nèi)p Y-STAT3和p S-STAT3表達(dá)情況;蛋白免疫印跡檢測腦組織中線粒體中p Y-STAT3、p S-STAT3、JAK2、p-JAK2蛋白表達(dá)。2.體外培養(yǎng)N2a細(xì)胞,建立細(xì)胞OGD/R模型,分別用AG490、LY294002、U0126抑制劑與葉酸缺乏聯(lián)合干預(yù),CCK-8檢測細(xì)胞活力,Western blot檢測線粒體中p Y-STAT3、p S-STAT3、p-ERK1/2、p-AKT、p-JNK、JNK的表達(dá)情況。結(jié)果1.與MCAO組比較,葉酸缺乏干預(yù)組:TTC染色法結(jié)果顯示腦梗死體積增大;FJB染色法結(jié)果顯示神經(jīng)細(xì)胞損傷明顯加重;透射電鏡觀察及線粒體損傷評分結(jié)果顯示,線粒體嚴(yán)重?fù)p傷;免疫熒光檢測結(jié)果顯示,大腦海馬皮質(zhì)線粒體標(biāo)記物COX IV與p Y-STAT3、COX IV與p S-STAT3雙陽性細(xì)胞數(shù)均進(jìn)一步增加;Western blot檢測結(jié)果顯示,腦組織線粒體中p Y-STAT3、p S-STAT3、p-JAK2蛋白表達(dá)均升高,以上各個指標(biāo)兩組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。與MCAO+FD組比較,MCAO+FD+AG490組:神經(jīng)細(xì)胞損傷減輕;腦組織線粒體損傷減輕;免疫熒光檢測結(jié)果顯示,大腦皮質(zhì)區(qū)線粒體COX IV與p Y-STAT3雙陽性細(xì)胞數(shù)較少;Western blot檢測結(jié)果顯示,腦組織中線粒體中p Y-STAT3、p-JAK2表達(dá)降低,以上各個指標(biāo)的兩組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。p S-STAT3蛋白表達(dá)量無明顯改變(P0.05)。2.體外培養(yǎng)N2a細(xì)胞,建立細(xì)胞OGD/R模型,Western blot檢測結(jié)果顯示,細(xì)胞復(fù)氧30 min時,N2a細(xì)胞線粒體中p Y-STAT3蛋白表達(dá)量達(dá)到高峰;細(xì)胞復(fù)氧45 min時,p S-STAT3蛋白表達(dá)量達(dá)到高峰。分別用AG490、LY294002、U0126與葉酸缺乏聯(lián)合干預(yù)細(xì)胞,Western blot檢測結(jié)果顯示,與對照組比,OGD/R組細(xì)胞線粒體中的p Y-STAT3、p S-STAT3、p-ERK1/2、p-AKT表達(dá)量增加,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),而p-JNK蛋白無明顯變化(P0.05)。與OGD/R組比較,OGD/R+FD組細(xì)胞線粒體中的p Y-STAT3、p S-STAT3、p-ERK1/2、p-AKT表達(dá)量進(jìn)一步增加,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),p-JNK蛋白無明顯變化(P0.05)。與OGD/R+FD相比,OGD/R+FD+AG490組p Y-STAT3蛋白表達(dá)量下降,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),p S-STAT3蛋白表達(dá)量無明顯變化(P0.05);OGD/R+FD+LY294002組、OGD/R+FD+U0126組p S-STAT3蛋白表達(dá)水平下降,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),p Y-STAT3蛋白表達(dá)量無明顯變化(P0.05)。CCK-8結(jié)果顯示:與對照組相比,OGD/R組細(xì)胞活力下降,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。與OGD/R組相比,OGD/R+FD組細(xì)胞活力進(jìn)一步下降,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);與OGD/R+FD組相比,OGD/R+FD+AG490組、OGD/R+FD+LY294002組、OGD/R+FD+U0126組細(xì)胞活力均上升,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論建立大鼠腦缺血再灌注模型,發(fā)現(xiàn)葉酸缺乏增加了腦缺血再灌注后腦梗死面積、神經(jīng)細(xì)胞凋亡及線粒體損傷,上調(diào)腦組織線粒體中p Y-STAT3、p S-STAT3 p-JAK2的表達(dá),給予JAK2/STAT3通路抑制劑AG490后,葉酸缺乏引起的上述效應(yīng)除p S-STAT3的表達(dá)量無明顯改變外,其余均在一定程度上被抑制。說明葉酸缺乏可能部分通過JAK2/STAT3通路上調(diào)線粒體中p Y-STAT3加劇大腦缺血后腦組織及線粒體損傷,葉酸缺乏對p S-STAT3的表達(dá)調(diào)控可能與JAK2/STAT3通路的激活無關(guān)。體外實驗成功建立N2a細(xì)胞OGD/R模型。葉酸缺乏干預(yù)后,上調(diào)細(xì)胞線粒體中p Y-STAT3、p S-STAT3、p-ERK1/2、p-AKT,細(xì)胞活力顯著下降。給予AG490抑制劑后,細(xì)胞活力升高,p Y-STAT3的表達(dá)量下降,p S-STAT3的表達(dá)量無明顯改變,與體內(nèi)結(jié)果一致。給予LY294002或U0126抑制劑后,細(xì)胞活力均升高,p S-STAT3表達(dá)量下降,p-ERK1/2或p-AKT的表達(dá)量下調(diào),p Y-STAT3的表達(dá)量無明顯改變,提示葉酸缺乏對線粒體p S-STAT3的調(diào)控可能與PI3K-AKT、MAPK/ERK1/2兩條通路有關(guān),且對p Y-STAT3的調(diào)控獨立于這兩條通路。p-JNK蛋白無明顯改變,提示JNK通路可能未參與到STAT3的活化過程。綜上兩部分結(jié)果,我們得出結(jié)論:葉酸缺乏可以通過JAK2/STAT3通路上調(diào)線粒體中p Y-STAT3,通過PI3K/AKT、MAPK/ERK1/2通路上調(diào)線粒體中p S-STAT3,以上通路協(xié)同作用下加劇了腦缺血后腦組織神經(jīng)細(xì)胞及線粒體損傷。
【圖文】：

1 葉酸缺乏對腦梗死大鼠梗死灶體積百分比的影響。A：各組大鼠腦組織 TTC 染色圖。組大鼠梗死灶體積統(tǒng)計分析。*：與 SHAM 組比較，#：與 MCAO 組比較，P<0.05.2.3 葉酸缺乏對腦缺血再灌注后大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞損傷的影響大鼠腦組織切片經(jīng) FJB 染色，倒置熒光顯微鏡下觀察大腦皮質(zhì)區(qū)缺血半附近陽性細(xì)胞數(shù)，結(jié)果顯示：SHAM 組大腦皮質(zhì)區(qū)陽性細(xì)胞數(shù)很少，MCA、MCAO+FD 組均可見數(shù)量不等的陽性細(xì)胞，見圖 2A。與 SHAM 組比較CAO 組陽性細(xì)胞數(shù)顯著增多，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與 MCAO 比，MCAO+FD 組陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)一步增多，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）圖 2B。

15圖 2 葉酸缺乏對腦梗死大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞損傷的影響。A：各組大鼠 FJB 染色結(jié)果（FJB綠色、DAPI 藍(lán)色、MERGE 為二者合圖）；B： FJB/DAPI 雙標(biāo)陽性細(xì)胞統(tǒng)計分析，*：與SHAM 組比較，#：與 MCAO 組比較，P<0.05，標(biāo)尺=50 μm，放大倍數(shù)=10×201.2.4 葉酸缺乏對缺血再灌大鼠腦組織線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響為了檢測葉酸缺乏對神經(jīng)系統(tǒng)線粒體的影響，在電鏡下對葉酸缺乏干預(yù)后腦缺血再灌注后大鼠皮質(zhì)區(qū)線粒體形態(tài)變化進(jìn)行觀察。結(jié)果如圖3A所示，SHAM組皮質(zhì)區(qū)的神經(jīng)元細(xì)胞，，細(xì)胞形態(tài)正常，核膜完整，各個細(xì)胞器未見腫脹或消失。線粒體形態(tài)正常，雙層膜完整，嵴排列規(guī)整。與 SHAM 組相比，腦缺血再灌 24 h 后，MCAO 組神經(jīng)元細(xì)胞部分線粒體發(fā)生腫脹，雙層膜不完整，嵴排列紊亂甚至斷裂，個別線粒體出現(xiàn)空泡化，少數(shù)線粒體保持完整結(jié)構(gòu)，其他細(xì)胞器部分發(fā)生腫脹。與 MCAO 組相比，MCAO+FD 組神經(jīng)元細(xì)胞損傷最為明顯，
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R743.3

【參考文獻(xiàn)】

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1 王若禺;羅麗麗;周邦健;帕孜麗亞艾尼;彭耀軍;張?zhí)K明;;葉酸在大鼠急性腦梗死的缺血再灌注中可能起保護(hù)作用[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2013年09期

本文編號：2666527