【摘要】：背景:腦出血(Intracerebral hemorrhage,ICH)是急性腦血管病中死亡率最高的疾病,而且易遺留運(yùn)動(dòng)認(rèn)知等多方面的功能障礙,給患者帶來極大痛苦,增加了社會(huì)負(fù)擔(dān)。盡管對(duì)腦出血發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了諸多研究,但進(jìn)展有限,尚未轉(zhuǎn)化為明顯的臨床獲益。探討腦出血早期病理變化及影響因素,尋找積極有效的治療方案,可能抓住治療時(shí)間窗提高療效。近年來的研究發(fā)現(xiàn),腦出血早期血腦屏障(Blood-brain barrier,BBB)通透性增加誘發(fā)腦水腫等繼發(fā)性腦損傷,是導(dǎo)致腦出血不良預(yù)后的主要原因。在此過程中,伴隨炎癥、氧化應(yīng)激和凋亡因子的激活,以級(jí)聯(lián)反應(yīng)模式,互相影響,加劇了腦組織結(jié)構(gòu)及功能損傷。因此加強(qiáng)對(duì)以上影響因素的研究,可能為腦出血的治療尋找到潛在的新方向。脂氧素(Lipoxins,LXs)是由脂氧合酶作用于花生四烯酸后生成的一種內(nèi)源性活性介質(zhì),脂氧素A4(Lipoxins A4,LXA4)是其主要生理活性形式之一,在各種炎癥相關(guān)性疾病方面發(fā)揮抗炎和促炎癥消退的作用。內(nèi)源性脂氧素在脫氫酶的作用下迅速失活,不穩(wěn)定,因人工合成的活性更穩(wěn)定的脂氧素類似物即甲酯化脂氧素A4(lipoxin A4methyl ester,LXA4 ME)被廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)研究。病理狀態(tài)下,脂氧素通過抑制炎性細(xì)胞的募集和活性氧生成,調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞活性,下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶-9(Matrix metalloproteinases-9,MMP-9)的表達(dá)等途徑,在慢性神經(jīng)退行性病變、缺血再灌注腦損傷、腦創(chuàng)傷等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中,發(fā)揮著十分重要的作用。但脂氧素對(duì)腦出后繼發(fā)腦損傷的神經(jīng)保護(hù)作用,尤其對(duì)腦出血早期的影響及有關(guān)調(diào)控機(jī)制尚不清楚。目的:探討LXA4 ME對(duì)大鼠腦出血早期繼發(fā)性損傷的神經(jīng)保護(hù)作用及相關(guān)調(diào)控機(jī)制。方法:1.通過自體血建立大鼠ICH模型,側(cè)腦室注射藥物L(fēng)XA4 ME(低劑量組:10ng/ul,高劑量組:100ng/ul)治療,術(shù)后1-5天通過改良神經(jīng)嚴(yán)重程度評(píng)分(Modified neurological severity score,MNSS)和轉(zhuǎn)棒試驗(yàn)評(píng)估大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)情況。于術(shù)后24h處死大鼠取腦,通過HE染色和尼氏染色,觀察腦組織病理形態(tài)變化和神經(jīng)細(xì)胞存活情況;尼式染色觀察ICH后24h血腫周圍腦組織神經(jīng)元密度。通過腦組織含水量及伊文思藍(lán)(Evans blue,EB)測(cè)定,評(píng)估ICH后1-3天血腦屏障的通透性變化。2.通過末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)缺口末端標(biāo)記(Terminal-deoxy nucleoitidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL)法檢測(cè)細(xì)胞凋亡;Western-blot檢測(cè)ICH后血腫周圍區(qū)受損腦組織中促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-κBp65和BBB通透性相關(guān)因子MMP-9、Occludin、閉鎖小帶蛋白(Zonulaoccludens1,ZO)-1的表達(dá);凝膠酶譜電泳分析檢測(cè)MMP-9的活性。探討甲酯化脂氧素A4在腦出血中的抗炎及降低血腦屏障通透性的作用機(jī)制。3.給予丙二醇甲醚醋酸酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)干預(yù),通過MNSS和轉(zhuǎn)棒試驗(yàn)評(píng)估大鼠神經(jīng)功能障礙情況;TUNEL法檢測(cè)神經(jīng)元凋亡;Western-blot及RT-PCR檢測(cè)ICH后血腫周圍區(qū)受損腦組織中炎癥因子NF-κBp65,線粒體功能相關(guān)蛋白腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)子-1(Adenine nucleotide translocator-1,ANT1),融合蛋白2(Mitofusin 2,MFN2),凋亡相關(guān)因子細(xì)胞色素C(Cytochrome,CytoC),Bcl-2/Bax,caspase-3的表達(dá);同時(shí)檢測(cè)線粒體活性氧(Reactive oxygen species,ROS)、三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)及線粒體膜電位,評(píng)估線粒體功能障礙情況。結(jié)果:1.大鼠ICH后神經(jīng)細(xì)胞腫脹,神經(jīng)元數(shù)量減少,血腦屏障通透性和腦含水量增加,神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能障礙(P0.05)。給予LXA4 ME治療,可以改善神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化,減輕腦水腫,改善ICH大鼠神經(jīng)功能障礙(P0.05),起到神經(jīng)保護(hù)作用,且該作用呈劑量依賴性。2.大鼠腦出血后,血腫周圍區(qū)域神經(jīng)元凋亡增加(P0.05),IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-κBp65、MMP-9表達(dá)增加(P0.05),而Occludin、ZO-1的表達(dá)減少(P0.05),MMP-9的活性增加(P0.05)。LXA4 ME通過NF-κB/MMP-9通路抑制炎癥反應(yīng)、減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡,降低血腦屏障通透性。3.通過PMA激活NF-κB,促進(jìn)了神經(jīng)功能損傷,增加神經(jīng)元凋亡(P0.05);降低ANT1、MFN2、Bcl-2的蛋白和mRNA水平表達(dá)(P0.05),增加了線粒體NF-κBp65、CytoC、Bax、caspase-3蛋白和mRNA表達(dá)(P0.05);同時(shí)增加線粒體ROS含量,降低線粒體ATP和膜電位(P0.05)。結(jié)論:甲酯化脂氧素A4通過抑制炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡,減輕早期腦出血后神經(jīng)功能損傷,該神經(jīng)保護(hù)作用可能是通過抑制NF-κB/MMP-9通路的激活來實(shí)現(xiàn)的。
【圖文】：

點(diǎn)狀傷口無滲血。造模術(shù)后 24h 處死大鼠，完整取出腦組織進(jìn)行大體觀。自血腫注入點(diǎn)冠狀面切割，，觀察發(fā)現(xiàn)尾狀核鄰近有一明顯血腫，并且腫周圍局部腦組織有損傷，此后觀察到腦室有少量出血。綜合以上觀察果說明，大鼠 ICH 模型制備成功，符合進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)要求（Fig.1）。

固縮壞死的細(xì)胞和炎性細(xì)胞數(shù)量減少。ICH+ LXA4 ME-L 治療組的織形態(tài)改變介于 Vehicle 組和 ICH+ LXA4 ME-H 治療組之間。通過以上結(jié)果說明 LXA4 ME-H 治療后能夠明顯減輕 ICH 后腦組織損傷，減少細(xì)胞壞死（Fig.2）
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R743.34

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本文編號(hào)：2664588