【摘要】：第一部分鞍區(qū)朗格漢斯細(xì)胞組織細(xì)胞增生癥和生殖細(xì)胞瘤患者的臨床特征背景及目的中樞性尿崩癥的病因診斷是內(nèi)分泌臨床診療的難點(diǎn)之一,特別是僅表現(xiàn)為垂體柄增粗的患者診斷更加困難,導(dǎo)致垂體柄增粗的病因很多,其中朗格漢斯細(xì)胞組織細(xì)胞增生癥(LCH)、生殖細(xì)胞瘤、自身免疫垂體炎等較為常見。LCH和生殖細(xì)胞瘤的鑒別診斷困難,缺乏特異性的診斷標(biāo)記物,目前病情進(jìn)展的患者通常通過活檢取得最終的病理診斷,但有創(chuàng)的病因診斷方法風(fēng)險(xiǎn)大且易造成不可逆的垂體功能損傷,及早、正確和安全的的病因診斷對患者的預(yù)后具有重要的臨床意義。因此,本課題的研究目的是總結(jié)鞍區(qū)LCH與鞍區(qū)生殖細(xì)胞瘤患者的臨床病理特點(diǎn),用以提高臨床鑒別診斷水平。方法本研究為回顧性的臨床病例研究,收集1993年7月至2017年7月之間在北京協(xié)和醫(yī)院確診為鞍區(qū)LCH或鞍區(qū)生殖細(xì)胞瘤的患者共181例,其中鞍區(qū)LCH患者為89例,鞍區(qū)生殖細(xì)胞瘤患者為92例,歸納總結(jié)其臨床特征。連續(xù)變量資料中符合正態(tài)分布的采用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析,符合偏態(tài)分布的采用Mann-Whitney U檢驗(yàn);分類變量資料采用卡方檢驗(yàn)或Fisher確切分析法進(jìn)行分析。本研究中采用雙側(cè)p值,雙側(cè)p值小于0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果共納入89例鞍區(qū)LCH患者以及92例鞍區(qū)生殖細(xì)胞瘤患者。LCH患者中男性患者52例,女性患者37例(男女比為1.4:1)。生殖細(xì)胞瘤患者中男性患者38例,女性患者54例(男女比為0.7:1)。LCH患者年齡中位數(shù)為23.0歲(1-53歲),生殖細(xì)胞瘤患者年齡中位數(shù)為12.5歲(4-35歲),較LCH患者小,有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.001)。在LCH與生殖細(xì)胞瘤患者中,中樞性尿崩癥(central diabetes insipidus,CDI)均為最常見的首發(fā)癥狀,發(fā)生率分別是70.8%、77.2%。89例LCH患者均為活檢確診,其中鞍區(qū)活檢14例;92例生殖細(xì)胞瘤患者中,83例為顱內(nèi)活檢確診,9例為臨床診斷。不同病因?qū)颊叽贵w前葉功能的影響不同,鞍區(qū)LCH最常受累的是HPG軸(48.3%),其次是 HPT 軸(39.3%)、GH-IGF-1 軸(39.3%)以及 HPA 軸(28.1%);鞍區(qū)生殖細(xì)胞瘤最常受累的是HPT軸(67.4%),其次是HPA軸(65.2%)、HPG軸(51.1%)和 GH-IGF-1 軸(47.8%)。血清學(xué)和腦脊液生化檢測方面,LCH患者腦脊液檢驗(yàn)的總細(xì)胞數(shù)(LCH,中位 7.0×106/L(0-7200.0×106/L);生殖細(xì)胞瘤,中位 28.0×106/L(0-7815.0×106/L);p=0.001)、白細(xì)胞數(shù)(LCH,中位1.5×106/L(0-8.O×106/L);生殖細(xì)胞瘤,中位4.0×106/L(0-62.0×106/L);p=0.002)、單核細(xì)胞數(shù)(LCH,中位 0.5×106/L(0-5.O×106/L);生殖細(xì)胞瘤,中位 6.0×106/L(0-52.0×106/L);p0.001)、葡萄糖(LCH,中位 3.3mmol/L(2.8-6.9mmol/L);生殖細(xì)胞瘤,中位 3.2mmol/L(2.4-4.6mmol/L);p=0.010)以及 β-hCG(LCH,中位 3.5 mIU/ml(0-6.6 mIU/ml);生殖細(xì)胞瘤,中位5.4 mIU/ml(0.2-36.3 mIU/ml);p=0.032)在兩組中有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。血清β-hCG在LCH患者中為中位0.1mIU/ml(0-6.0mIU/ml),生殖細(xì)胞瘤患者中為中位1.3 mIU/ml(0-40.4mIU/ml),生殖細(xì)胞瘤患者腦脊液β-hCG水平顯著高于LCH(p0.001)。根據(jù)頭顱核磁共振影像分析,LCH與生殖細(xì)胞瘤患者單純累及垂體柄的最多,各有28例(47.5%)和40例(43.5%);累及垂體柄和垂體的分別有1例(1.7%)和16例(17.4%),累及垂體柄和下丘腦的分別有6例(10.2%)和9例(9.8%),累及垂體柄、垂體和下丘腦的分別有6例(10.2%)和17例(18.5%),累及頭顱其他部位的分別有18例(30.5%)和10例(10.9%)。結(jié)論本研究表明在本中心患者中,LCH患者的男性比例及發(fā)病年齡顯著高于生殖細(xì)胞瘤患者,腦脊液總細(xì)胞數(shù)、白細(xì)胞數(shù)、單核細(xì)胞數(shù)、β-hCG及血清β-hCG顯著低于鞍區(qū)生殖細(xì)胞瘤患者,腦脊液葡萄糖顯著高于生殖細(xì)胞瘤患者,最常受累的是HPG軸,其次是HPT軸、GH-IGF-1軸以及HPA軸,而鞍區(qū)生殖細(xì)胞瘤最常受累的是HPT軸,其次是HPA軸、HPG軸和GH-IGF-1軸。但病因?qū)W診斷仍是此類患者的診斷難點(diǎn),缺乏特異性的診斷標(biāo)志物。第二部分鞍區(qū)朗格漢斯細(xì)胞組織細(xì)胞增生癥和鞍區(qū)生殖細(xì)胞瘤患者腦脊液細(xì)胞的特征基因表達(dá)的分析研究背景鞍區(qū)LCH和鞍區(qū)生殖細(xì)胞瘤的鑒別診斷主要依靠病理免疫組化,LCH的特異性標(biāo)記物包括CDla、S-100、CD207蛋白,生殖細(xì)胞瘤的特異標(biāo)記物包括PLAP、OCT3/4、SALL4蛋白等。然而鞍區(qū)活檢風(fēng)險(xiǎn)大、有時活檢組織太少而檢出率不高,且患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)與心理負(fù)擔(dān)較重。既往研究表明,鞍區(qū)LCH和鞍區(qū)生殖細(xì)胞瘤的腦脊液中均可能找到脫落的腫瘤細(xì)胞,然而常規(guī)細(xì)胞學(xué)檢查檢出率很低,應(yīng)用受限。目的本研究嘗試?yán)谩耙簯B(tài)活檢”的思路,采用數(shù)字PCR(Droplet Digital PCR,ddPCR)的方法,建立腦脊液中脫落細(xì)胞的特異基因的表達(dá)檢測平臺,對LCH和生殖細(xì)胞瘤相關(guān)特異基因的表達(dá)水平進(jìn)行檢測,探索其鑒別兩種疾病的可行性。方法收集2018年2月至2018年5月北京協(xié)和醫(yī)院內(nèi)分泌科及神經(jīng)外科懷疑鞍區(qū)LCH或鞍區(qū)生殖細(xì)胞瘤患者的腦脊液和臨床資料,包括活檢免疫組化結(jié)果。共9例,男女比例為1:8。另收集1例腦積水患者的腦脊液作為陰性對照。分別用兩步法ddPCR和一步法ddPCR對腦脊液細(xì)胞進(jìn)行特異標(biāo)記基因的mRNA水平進(jìn)行檢測。具體操作如下,留取lml腦脊液,離心,取細(xì)胞沉淀進(jìn)行RNA提取。兩步法ddPCR檢測,首先進(jìn)行總RNA逆轉(zhuǎn)錄,然后用cDNA配制反應(yīng)體系,進(jìn)行PCR擴(kuò)增和檢測;一步法ddPCR檢測,直接用總RNA配制反應(yīng)體系,反轉(zhuǎn)錄、PCR擴(kuò)增和檢測一起進(jìn)行。檢測的基因包括LCH的特異性標(biāo)記物基因CDla、S-100、CD207和生殖細(xì)胞瘤的特異標(biāo)記基因PLAP、OCT3/4、SALL4。檢測結(jié)果采用QuantaSoft進(jìn)行分析數(shù)據(jù)。根據(jù)無模版對照的微滴信號劃定閾值線,超過閾值線的視為陽性微滴。根據(jù)體系中核酸拷貝數(shù)計(jì)算腦脊液中的特異標(biāo)記基因的核酸濃度。結(jié)果采用數(shù)字PCR(ddPCR)方法,初步建立鑒別診斷鞍區(qū)LCH和鞍區(qū)生殖細(xì)胞瘤患者腦脊液細(xì)胞中的特征性基因表達(dá)分析的方法。首先,采用兩步法擴(kuò)增P#l-6患者的內(nèi)參基因β-actin。結(jié)果發(fā)現(xiàn)6個樣本的內(nèi)參基因均能擴(kuò)增,而且表達(dá)量高,為5.96×105-108/mlCSF,提示兩步法可以用于內(nèi)參基因的ddPCR擴(kuò)增。其次,采用兩步法擴(kuò)增LCH的特異性標(biāo)記物基因CD1a、S-100、CD207和生殖細(xì)胞瘤的特異標(biāo)記基因PLAP、OCT3/4、SALL4,結(jié)果發(fā)現(xiàn),6個特征性表達(dá)的基因均能良好擴(kuò)增,提示兩種疾病的特征性表達(dá)基因也能采用兩步法進(jìn)行ddPCR的擴(kuò)增。再次,采用一步法擴(kuò)增P#9患者的特征性表達(dá)的基因,結(jié)果發(fā)現(xiàn),特征性表達(dá)基因也能很好地?cái)U(kuò)增,而且擴(kuò)增的拷貝數(shù)遠(yuǎn)大于兩步法,陽性微滴較密集,與陰性微滴分界清晰。減少上樣總RNA量,特征性表達(dá)的基因也能良好擴(kuò)增,判讀結(jié)果具有一致性。選擇3ul總RNA上樣量是最合適的。最后,才用一步法,對作為陰性對照的腦積水患者進(jìn)行了上述兩次ddPCR擴(kuò)增,均無陽性微滴,說明該方法的特異性較好。采用上述建立的ddPCR方法(一步法和兩步法),擴(kuò)增鞍區(qū)LCH和鞍區(qū)生殖細(xì)胞瘤患者腦脊液細(xì)胞中的特征性表達(dá)基因。P#1-3患者采用兩步法對腦脊液細(xì)胞進(jìn)行上述6個基因mRNA水平的檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),P#1患者的S-100、CD207基因擴(kuò)增判讀為陽性,拷貝數(shù)分別為23.2個/ml CSF、128個/ml CSF;P#2患者的S-100、CD207基因擴(kuò)增判讀為陽性,拷貝數(shù)分別為644個/mlCSF、140個/ml CSF;其余基因擴(kuò)增判讀為陰性,提示這兩名患者可能為LCH。臨床尚未給出明確診斷。P#3患者的S-100、CD207陽性,拷貝數(shù)分別為57.4/ml CSF、84/ml CSF,提示可能為LCH,臨床上也疑診LCH。P#4-6患者采用兩步法進(jìn)行腦脊液細(xì)胞CD1a、S-100、OCT3/4的mRNA水平的檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)P#4-6患者的CD1a、S-100、OCT3/4均為陰性,其中P#4臨床活檢診斷為節(jié)細(xì)胞膠質(zhì)瘤,P#5、6臨床診斷不明。P#7-9患者采用一步法進(jìn)行檢測,其中P#7患者無陽性微滴,提示既不是LCH,也不是生殖細(xì)胞瘤,臨床活檢病理診斷為顆粒細(xì)胞瘤;P#8患者的CD1a、CD207基因擴(kuò)增判讀為陽性,拷貝數(shù)分別為1080個/ml CSF、468個/ml CSF,提示可能為LCH,臨床活檢病理診斷為LCH,免疫組化示S-100陽性,SALL4陰性;P#9進(jìn)行一步法三次重復(fù)檢測,均為CD1a、S-100、CD207、PLAP、OCT3/4陽性,臨床病理診斷為生殖細(xì)胞瘤,免疫組化示S-100、OCT3/4和SALL4陽性。結(jié)論初步嘗試建立了采用ddPCR方法,鑒別鞍區(qū)LCH和鞍區(qū)生殖細(xì)胞瘤患者腦脊液細(xì)胞中的特征性基因表達(dá)分析的方法。一步法和兩步法ddPCR均能擴(kuò)增兩種疾病患者腦脊液細(xì)胞中的特征性表達(dá)基因,但一步法的擴(kuò)增效率高,重復(fù)性好。臨床可行性尚需擴(kuò)大樣本量進(jìn)行進(jìn)一步的研究。P#1-3、P#8患者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示為LCH,其中P#3患者臨床疑診LCH、P#8患者臨床活檢確診LCH;P#4-7患者目前實(shí)驗(yàn)結(jié)果不支持LCH或生殖細(xì)胞瘤,其中P#4患者活檢為節(jié)細(xì)胞膠質(zhì)瘤、P#7患者為顆粒細(xì)胞瘤。P#9患者生殖細(xì)胞瘤和LCH相關(guān)標(biāo)記物均陽性,臨床活檢診斷為生殖細(xì)胞瘤。
【圖文】：

（６７．４％），其次為邋ＨＰＡ邋軸邋６０邋例（６５．２％）、ＨＰＧ邋軸邋４７邋例（５１．１％）、ＧＨ－ＩＧＦ－１逡逑軸４４例（４７．８％），ＬＣＨ患者有９例（１０．１％）表現(xiàn)為全垂體前葉功能受損，生逡逑殖細(xì)胞瘤患者有１８例（１９．６％）（表３，圖１）。逡逑１７逡逑

邐北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院博士研宄生論文界清晰（圖３－２、圖３－４），，ｐ－ａｃｔｉｎ拷貝數(shù)足夠多（表３－２、３－３）。逡逑１）邐Ｐ＃ｌ、Ｐ＃２、Ｐ＃３患者兩步法ｄｄＰＣＲ擴(kuò)增ｐ－ａｃｔｉｎ的微滴生成、擴(kuò)增信號值基因拷貝數(shù)見圖３－１、圖３－２和表３－２。逡逑２００００邋邐邋１９１０７邐邐逡逑１８００１邐…
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R739.41

【參考文獻(xiàn)】

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1 鮑達(dá)明;丁伯海;葛剛鋒;林家華;張克劬;;經(jīng)蝶切除垂體腺瘤的實(shí)用解剖學(xué)研究[J];實(shí)用腫瘤雜志;1992年02期

本文編號：2663534