【摘要】：第一部分鞍區(qū)朗格漢斯細胞組織細胞增生癥和生殖細胞瘤患者的臨床特征背景及目的中樞性尿崩癥的病因診斷是內分泌臨床診療的難點之一,特別是僅表現(xiàn)為垂體柄增粗的患者診斷更加困難,導致垂體柄增粗的病因很多,其中朗格漢斯細胞組織細胞增生癥(LCH)、生殖細胞瘤、自身免疫垂體炎等較為常見。LCH和生殖細胞瘤的鑒別診斷困難,缺乏特異性的診斷標記物,目前病情進展的患者通常通過活檢取得最終的病理診斷,但有創(chuàng)的病因診斷方法風險大且易造成不可逆的垂體功能損傷,及早、正確和安全的的病因診斷對患者的預后具有重要的臨床意義。因此,本課題的研究目的是總結鞍區(qū)LCH與鞍區(qū)生殖細胞瘤患者的臨床病理特點,用以提高臨床鑒別診斷水平。方法本研究為回顧性的臨床病例研究,收集1993年7月至2017年7月之間在北京協(xié)和醫(yī)院確診為鞍區(qū)LCH或鞍區(qū)生殖細胞瘤的患者共181例,其中鞍區(qū)LCH患者為89例,鞍區(qū)生殖細胞瘤患者為92例,歸納總結其臨床特征。連續(xù)變量資料中符合正態(tài)分布的采用t檢驗進行分析,符合偏態(tài)分布的采用Mann-Whitney U檢驗;分類變量資料采用卡方檢驗或Fisher確切分析法進行分析。本研究中采用雙側p值,雙側p值小于0.05認為具有統(tǒng)計學意義。結果共納入89例鞍區(qū)LCH患者以及92例鞍區(qū)生殖細胞瘤患者。LCH患者中男性患者52例,女性患者37例(男女比為1.4:1)。生殖細胞瘤患者中男性患者38例,女性患者54例(男女比為0.7:1)。LCH患者年齡中位數(shù)為23.0歲(1-53歲),生殖細胞瘤患者年齡中位數(shù)為12.5歲(4-35歲),較LCH患者小,有明顯統(tǒng)計學差異(p0.001)。在LCH與生殖細胞瘤患者中,中樞性尿崩癥(central diabetes insipidus,CDI)均為最常見的首發(fā)癥狀,發(fā)生率分別是70.8%、77.2%。89例LCH患者均為活檢確診,其中鞍區(qū)活檢14例;92例生殖細胞瘤患者中,83例為顱內活檢確診,9例為臨床診斷。不同病因對患者垂體前葉功能的影響不同,鞍區(qū)LCH最常受累的是HPG軸(48.3%),其次是 HPT 軸(39.3%)、GH-IGF-1 軸(39.3%)以及 HPA 軸(28.1%);鞍區(qū)生殖細胞瘤最常受累的是HPT軸(67.4%),其次是HPA軸(65.2%)、HPG軸(51.1%)和 GH-IGF-1 軸(47.8%)。血清學和腦脊液生化檢測方面,LCH患者腦脊液檢驗的總細胞數(shù)(LCH,中位 7.0×106/L(0-7200.0×106/L);生殖細胞瘤,中位 28.0×106/L(0-7815.0×106/L);p=0.001)、白細胞數(shù)(LCH,中位1.5×106/L(0-8.O×106/L);生殖細胞瘤,中位4.0×106/L(0-62.0×106/L);p=0.002)、單核細胞數(shù)(LCH,中位 0.5×106/L(0-5.O×106/L);生殖細胞瘤,中位 6.0×106/L(0-52.0×106/L);p0.001)、葡萄糖(LCH,中位 3.3mmol/L(2.8-6.9mmol/L);生殖細胞瘤,中位 3.2mmol/L(2.4-4.6mmol/L);p=0.010)以及 β-hCG(LCH,中位 3.5 mIU/ml(0-6.6 mIU/ml);生殖細胞瘤,中位5.4 mIU/ml(0.2-36.3 mIU/ml);p=0.032)在兩組中有明顯統(tǒng)計學差異。血清β-hCG在LCH患者中為中位0.1mIU/ml(0-6.0mIU/ml),生殖細胞瘤患者中為中位1.3 mIU/ml(0-40.4mIU/ml),生殖細胞瘤患者腦脊液β-hCG水平顯著高于LCH(p0.001)。根據(jù)頭顱核磁共振影像分析,LCH與生殖細胞瘤患者單純累及垂體柄的最多,各有28例(47.5%)和40例(43.5%);累及垂體柄和垂體的分別有1例(1.7%)和16例(17.4%),累及垂體柄和下丘腦的分別有6例(10.2%)和9例(9.8%),累及垂體柄、垂體和下丘腦的分別有6例(10.2%)和17例(18.5%),累及頭顱其他部位的分別有18例(30.5%)和10例(10.9%)。結論本研究表明在本中心患者中,LCH患者的男性比例及發(fā)病年齡顯著高于生殖細胞瘤患者,腦脊液總細胞數(shù)、白細胞數(shù)、單核細胞數(shù)、β-hCG及血清β-hCG顯著低于鞍區(qū)生殖細胞瘤患者,腦脊液葡萄糖顯著高于生殖細胞瘤患者,最常受累的是HPG軸,其次是HPT軸、GH-IGF-1軸以及HPA軸,而鞍區(qū)生殖細胞瘤最常受累的是HPT軸,其次是HPA軸、HPG軸和GH-IGF-1軸。但病因學診斷仍是此類患者的診斷難點,缺乏特異性的診斷標志物。第二部分鞍區(qū)朗格漢斯細胞組織細胞增生癥和鞍區(qū)生殖細胞瘤患者腦脊液細胞的特征基因表達的分析研究背景鞍區(qū)LCH和鞍區(qū)生殖細胞瘤的鑒別診斷主要依靠病理免疫組化,LCH的特異性標記物包括CDla、S-100、CD207蛋白,生殖細胞瘤的特異標記物包括PLAP、OCT3/4、SALL4蛋白等。然而鞍區(qū)活檢風險大、有時活檢組織太少而檢出率不高,且患者經(jīng)濟負擔與心理負擔較重。既往研究表明,鞍區(qū)LCH和鞍區(qū)生殖細胞瘤的腦脊液中均可能找到脫落的腫瘤細胞,然而常規(guī)細胞學檢查檢出率很低,應用受限。目的本研究嘗試利用“液態(tài)活檢”的思路,采用數(shù)字PCR(Droplet Digital PCR,ddPCR)的方法,建立腦脊液中脫落細胞的特異基因的表達檢測平臺,對LCH和生殖細胞瘤相關特異基因的表達水平進行檢測,探索其鑒別兩種疾病的可行性。方法收集2018年2月至2018年5月北京協(xié)和醫(yī)院內分泌科及神經(jīng)外科懷疑鞍區(qū)LCH或鞍區(qū)生殖細胞瘤患者的腦脊液和臨床資料,包括活檢免疫組化結果。共9例,男女比例為1:8。另收集1例腦積水患者的腦脊液作為陰性對照。分別用兩步法ddPCR和一步法ddPCR對腦脊液細胞進行特異標記基因的mRNA水平進行檢測。具體操作如下,留取lml腦脊液,離心,取細胞沉淀進行RNA提取。兩步法ddPCR檢測,首先進行總RNA逆轉錄,然后用cDNA配制反應體系,進行PCR擴增和檢測;一步法ddPCR檢測,直接用總RNA配制反應體系,反轉錄、PCR擴增和檢測一起進行。檢測的基因包括LCH的特異性標記物基因CDla、S-100、CD207和生殖細胞瘤的特異標記基因PLAP、OCT3/4、SALL4。檢測結果采用QuantaSoft進行分析數(shù)據(jù)。根據(jù)無模版對照的微滴信號劃定閾值線,超過閾值線的視為陽性微滴。根據(jù)體系中核酸拷貝數(shù)計算腦脊液中的特異標記基因的核酸濃度。結果采用數(shù)字PCR(ddPCR)方法,初步建立鑒別診斷鞍區(qū)LCH和鞍區(qū)生殖細胞瘤患者腦脊液細胞中的特征性基因表達分析的方法。首先,采用兩步法擴增P#l-6患者的內參基因β-actin。結果發(fā)現(xiàn)6個樣本的內參基因均能擴增,而且表達量高,為5.96×105-108/mlCSF,提示兩步法可以用于內參基因的ddPCR擴增。其次,采用兩步法擴增LCH的特異性標記物基因CD1a、S-100、CD207和生殖細胞瘤的特異標記基因PLAP、OCT3/4、SALL4,結果發(fā)現(xiàn),6個特征性表達的基因均能良好擴增,提示兩種疾病的特征性表達基因也能采用兩步法進行ddPCR的擴增。再次,采用一步法擴增P#9患者的特征性表達的基因,結果發(fā)現(xiàn),特征性表達基因也能很好地擴增,而且擴增的拷貝數(shù)遠大于兩步法,陽性微滴較密集,與陰性微滴分界清晰。減少上樣總RNA量,特征性表達的基因也能良好擴增,判讀結果具有一致性。選擇3ul總RNA上樣量是最合適的。最后,才用一步法,對作為陰性對照的腦積水患者進行了上述兩次ddPCR擴增,均無陽性微滴,說明該方法的特異性較好。采用上述建立的ddPCR方法(一步法和兩步法),擴增鞍區(qū)LCH和鞍區(qū)生殖細胞瘤患者腦脊液細胞中的特征性表達基因。P#1-3患者采用兩步法對腦脊液細胞進行上述6個基因mRNA水平的檢測,結果發(fā)現(xiàn),P#1患者的S-100、CD207基因擴增判讀為陽性,拷貝數(shù)分別為23.2個/ml CSF、128個/ml CSF;P#2患者的S-100、CD207基因擴增判讀為陽性,拷貝數(shù)分別為644個/mlCSF、140個/ml CSF;其余基因擴增判讀為陰性,提示這兩名患者可能為LCH。臨床尚未給出明確診斷。P#3患者的S-100、CD207陽性,拷貝數(shù)分別為57.4/ml CSF、84/ml CSF,提示可能為LCH,臨床上也疑診LCH。P#4-6患者采用兩步法進行腦脊液細胞CD1a、S-100、OCT3/4的mRNA水平的檢測。結果發(fā)現(xiàn)P#4-6患者的CD1a、S-100、OCT3/4均為陰性,其中P#4臨床活檢診斷為節(jié)細胞膠質瘤,P#5、6臨床診斷不明。P#7-9患者采用一步法進行檢測,其中P#7患者無陽性微滴,提示既不是LCH,也不是生殖細胞瘤,臨床活檢病理診斷為顆粒細胞瘤;P#8患者的CD1a、CD207基因擴增判讀為陽性,拷貝數(shù)分別為1080個/ml CSF、468個/ml CSF,提示可能為LCH,臨床活檢病理診斷為LCH,免疫組化示S-100陽性,SALL4陰性;P#9進行一步法三次重復檢測,均為CD1a、S-100、CD207、PLAP、OCT3/4陽性,臨床病理診斷為生殖細胞瘤,免疫組化示S-100、OCT3/4和SALL4陽性。結論初步嘗試建立了采用ddPCR方法,鑒別鞍區(qū)LCH和鞍區(qū)生殖細胞瘤患者腦脊液細胞中的特征性基因表達分析的方法。一步法和兩步法ddPCR均能擴增兩種疾病患者腦脊液細胞中的特征性表達基因,但一步法的擴增效率高,重復性好。臨床可行性尚需擴大樣本量進行進一步的研究。P#1-3、P#8患者的實驗結果顯示為LCH,其中P#3患者臨床疑診LCH、P#8患者臨床活檢確診LCH;P#4-7患者目前實驗結果不支持LCH或生殖細胞瘤,其中P#4患者活檢為節(jié)細胞膠質瘤、P#7患者為顆粒細胞瘤。P#9患者生殖細胞瘤和LCH相關標記物均陽性,臨床活檢診斷為生殖細胞瘤。
【圖文】：

（６７．４％），其次為邋ＨＰＡ邋軸邋６０邋例（６５．２％）、ＨＰＧ邋軸邋４７邋例（５１．１％）、ＧＨ－ＩＧＦ－１逡逑軸４４例（４７．８％），ＬＣＨ患者有９例（１０．１％）表現(xiàn)為全垂體前葉功能受損，生逡逑殖細胞瘤患者有１８例（１９．６％）（表３，圖１）。逡逑１７逡逑

邐北京協(xié)和醫(yī)學院博士研宄生論文界清晰（圖３－２、圖３－４），，ｐ－ａｃｔｉｎ拷貝數(shù)足夠多（表３－２、３－３）。逡逑１）邐Ｐ＃ｌ、Ｐ＃２、Ｐ＃３患者兩步法ｄｄＰＣＲ擴增ｐ－ａｃｔｉｎ的微滴生成、擴增信號值基因拷貝數(shù)見圖３－１、圖３－２和表３－２。逡逑２００００邋邐邋１９１０７邐邐逡逑１８００１邐…
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R739.41

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 鮑達明;丁伯海;葛剛鋒;林家華;張克劬;;經(jīng)蝶切除垂體腺瘤的實用解剖學研究[J];實用腫瘤雜志;1992年02期

本文編號：2663534