【摘要】：背景:帕金森病(Parkinson's disease,PD)是臨床上最常見的神經(jīng)退行性疾病之一,臨床上主要表現(xiàn)為靜止性震顫、肌強直、運動遲緩和姿勢平衡障礙等。大多數(shù)PD患者為散發(fā)性,但少數(shù)是由基因突變引起的遺傳性帕金森病。隨著遺傳學(xué)研究方法的不斷進步,尤其是高通量測序技術(shù)的發(fā)展,近年來遺傳性帕金森病新的致病基因被不斷發(fā)現(xiàn),而針對這些PD致病基因開展的系列功能研究對認識PD的發(fā)病機制有著重要意義。但仍有部分遺傳性帕金森病家系致病基因不明確。目的:在前期工作中,我們收集到一個中國漢族帕金森綜合征家系,本研究擬在前期工作基礎(chǔ)上,通過外顯子組測序技術(shù),探尋此帕金森綜合征家系的致病基因,利用PET-CT觀察此家系影像學(xué)特點。同時,分析其致病基因多態(tài)性與散發(fā)性PD的相關(guān)性。并在細胞模型及動物模型上進一步探討此基因突變致病的可能機制。方法:1詳細記錄本研究家系內(nèi)所有成員的臨床資料,對本家系內(nèi)2例患者進行全外顯子組測序,結(jié)合生物信息分析,尋找候選致病基因位點。并進行Sanger測序驗證,同時在相關(guān)病人及正常對照中進行驗證。2對家系內(nèi)2例患者及1例正常對照進行[11C］CFT標記的腦多巴胺轉(zhuǎn)運體PET-CT顯像及18F-FDG標記的腦葡萄糖代謝PET-CT顯像。3 納入364名散發(fā)性PD患者和384名正常對照,對CHCHD2基因進行Sanger測序,探討CHCHD2基因多態(tài)性與中國漢族人群散發(fā)性PD相關(guān)性。4 構(gòu)建CHCHD2野生型及突變型真核表達載體,及穩(wěn)定過表達野生型及突變型CHCHD2和穩(wěn)定抑制CHCHD2表達單克隆SHSY5Y細胞系。研究CHCHD2蛋白在細胞應(yīng)激條件下的表達情況,及T61I突變后蛋白穩(wěn)定性、亞細胞定位變化。5 運用已構(gòu)建的CHCHD2野生型及突變型過表達和表達抑制單克隆細胞系,研究突變后細胞活力、凋亡水平、凋亡蛋白表達水平、膜電位、活性氧、ATP及細胞有氧呼吸水平變化。分離并培養(yǎng)突變攜帶患者來源的皮膚成纖維細胞,研究CHCHD2及相關(guān)蛋白表達水平變化。6 檢測CHCHD2突變后磷酸化水平的改變。探討CHCHD2蛋白和RBPJ、COX1、CHCHD10及MICS1蛋白相互作用。檢測突變攜帶患者來源的皮膚成纖維細胞中CHCHD10相關(guān)蛋白表達水平,及線粒體形態(tài)改變。7利用家系內(nèi)CHCHD2T61I突變攜帶患者的外周血單個核細胞,誘導(dǎo)iPS細胞系并鑒定。利用小鼠胚胎干細胞打靶技術(shù),構(gòu)建CHCHD2T61I點突變小鼠模型。結(jié)果:1本研究納入的帕金森綜合征家系符合常染色體顯性遺傳規(guī)律。除帕金森癥狀外,先證者有重疊多系統(tǒng)萎縮的臨床特征,另一名家庭成員則表現(xiàn)為特發(fā)性震顫。應(yīng)用全外顯子組捕獲及高通量測序,結(jié)合后續(xù)生物信息學(xué)分析,我們發(fā)現(xiàn)CHCHD2基因的c.182CT(p.T61I)突變是本家系的致病位點。2 此家系內(nèi)攜帶CHCHD2 c.182CT(p.T61I)突變患者的PET-CT結(jié)果顯示,多巴胺轉(zhuǎn)運體顯像信號明顯減低,與臨床嚴重情況呈負相關(guān),與散發(fā)性PD患者結(jié)果類似。而其殼核和蒼白球葡萄糖代謝水平明顯增高,這也符合18F-FDG PET-CT的PD相關(guān)模式特點。3 在漢族散發(fā)性PD患者中,我們發(fā)現(xiàn)了 5個已知的多態(tài)位點:c.-11GA、c.-11GA、c.5C＞T、c.51-127GA、c.456+125GA。經(jīng)統(tǒng)計分析后,位點c.5CT的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(OR= 4.79,95%CI= 1.03-22.26,p = 0.03),其余四個位點在兩組間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。4成功構(gòu)建CHCHD2野生型及突變型真核表達載體,及篩選出CHCHD2穩(wěn)定過表達和穩(wěn)定抑制的單克隆細胞系。CHCHD2蛋白在細胞應(yīng)激條件下的高表達,T61I突變后蛋白穩(wěn)定性、亞細胞定位無明顯變化。5與對照相比,CHCHD2表達抑制的單克隆細胞系在細胞活力、凋亡水平、凋亡蛋白、膜電位、活性氧、ATP及細胞有氧呼吸水平均受到影響。而在穩(wěn)轉(zhuǎn)過表達細胞系中,和野生型蛋白相比,在應(yīng)激條件下,T61I突變后CHCHD2蛋白對細胞的保護作用喪失。在患者來源的皮膚成纖維細胞中,CHCHD2蛋白及mRNA水平均不改變。6 CHCHD2突變后磷酸化水平未改變。CHCHD2蛋白與CHCHD10蛋白存在相互作用,且CHCHD2突變后與CHCHD10結(jié)合水平更高�；颊邅碓吹钠つw成纖維細胞中CHCHD10及DRP1蛋白水平降低,CHCHD2與MICS1結(jié)合水平降低。CHCHD2突變患者皮膚成纖維細胞線粒體形態(tài)嚴重受損。7 構(gòu)建了患者來源疾病特異性CHCHD2突變型iPS細胞系,相關(guān)指標鑒定正確。構(gòu)建了 CHCHD2T61I點突變小鼠模型,鑒定正確。結(jié)論:1.CHCHD2基因的c.182CT(p.T611)突變是本研究納入的帕金森綜合征家系的致病位點,即CHCHD2突變可導(dǎo)致常染色體顯性帕金森綜合征。2.在散發(fā)性PD患者中,CHCHD2多態(tài)位點c.5CT與正常對照相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,表明攜帶c.5CT可能增加患PD的風(fēng)險。3.野生型CHCHD2蛋白對細胞具有保護作用,而T61I突變型CHCHD2蛋白并無細胞毒性,但是喪失了對細胞的保護功能。4.CHCHD2和CHCHD1O的相互作用可能在發(fā)病過程中起重要作用。5.成功構(gòu)建了患者來源的疾病特異性CHCHD2突變型iPS細胞系及CHCHD2 T61I點突變小鼠模型。
【圖文】：

圖１－１－１：本研[偰扇氳暮鶴逡糯耘兩鶘酆險骷蟻低計族義掀魃璞負褪約鈴義媳恚椋保樗玫降鬧饕瞧魃璞負褪約鈴義霞撩棋沃圃歟錚鴣⒘糠止夤舛紉清蚊攔裕瑁澹潁恚鎪俚臀呂胄幕危牛穡穡澹睿洌錚潁嫻雌麇偽本┝灰潛本┝灰牽幔齲椋螅澹瘢玻埃埃案咄坎廡蛞瞧麇蚊攔歟歟歟酰恚椋睿幔簦椋錚鑠澹櫻希希牽厥中酒教ㄥ蚊攔桑歟歟酰恚椋睿嶠灰清蚊攔桑歟歟酰恚椋睿幔徨澹校幔椋潁澹溴澹澹牛睿溴澹牽澹睿錚恚椋沐澹模危鈴澹櫻幔恚校桑邋澹校潁邋澹校耍椋翦迕攔澹桑歟歟酰恚椋睿徨澹幔校幔椋潁澹溴澹澹牛睿溴澹茫歟酰螅簦澹蟈澹牽澹睿澹潁幔簦椋錚鑠澹耍椋簦觶村蚊攔澹桑歟歟酰恚椋睿徨澹玻保埃板澹攏椋镥澹幔睿幔歟冢澹蟈危粒紓椋歟澹睿翦，

本文編號：2663472