發(fā)布時(shí)間：2020-05-14 14:11

【摘要】：背景:帕金森病(Parkinson's disease,PD)是臨床上最常見的神經(jīng)退行性疾病之一,臨床上主要表現(xiàn)為靜止性震顫、肌強(qiáng)直、運(yùn)動(dòng)遲緩和姿勢(shì)平衡障礙等。大多數(shù)PD患者為散發(fā)性,但少數(shù)是由基因突變引起的遺傳性帕金森病。隨著遺傳學(xué)研究方法的不斷進(jìn)步,尤其是高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,近年來遺傳性帕金森病新的致病基因被不斷發(fā)現(xiàn),而針對(duì)這些PD致病基因開展的系列功能研究對(duì)認(rèn)識(shí)PD的發(fā)病機(jī)制有著重要意義。但仍有部分遺傳性帕金森病家系致病基因不明確。目的:在前期工作中,我們收集到一個(gè)中國漢族帕金森綜合征家系,本研究擬在前期工作基礎(chǔ)上,通過外顯子組測(cè)序技術(shù),探尋此帕金森綜合征家系的致病基因,利用PET-CT觀察此家系影像學(xué)特點(diǎn)。同時(shí),分析其致病基因多態(tài)性與散發(fā)性PD的相關(guān)性。并在細(xì)胞模型及動(dòng)物模型上進(jìn)一步探討此基因突變致病的可能機(jī)制。方法:1詳細(xì)記錄本研究家系內(nèi)所有成員的臨床資料,對(duì)本家系內(nèi)2例患者進(jìn)行全外顯子組測(cè)序,結(jié)合生物信息分析,尋找候選致病基因位點(diǎn)。并進(jìn)行Sanger測(cè)序驗(yàn)證,同時(shí)在相關(guān)病人及正常對(duì)照中進(jìn)行驗(yàn)證。2對(duì)家系內(nèi)2例患者及1例正常對(duì)照進(jìn)行[11C］CFT標(biāo)記的腦多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體PET-CT顯像及18F-FDG標(biāo)記的腦葡萄糖代謝PET-CT顯像。3 納入364名散發(fā)性PD患者和384名正常對(duì)照,對(duì)CHCHD2基因進(jìn)行Sanger測(cè)序,探討CHCHD2基因多態(tài)性與中國漢族人群散發(fā)性PD相關(guān)性。4 構(gòu)建CHCHD2野生型及突變型真核表達(dá)載體,及穩(wěn)定過表達(dá)野生型及突變型CHCHD2和穩(wěn)定抑制CHCHD2表達(dá)單克隆SHSY5Y細(xì)胞系。研究CHCHD2蛋白在細(xì)胞應(yīng)激條件下的表達(dá)情況,及T61I突變后蛋白穩(wěn)定性、亞細(xì)胞定位變化。5 運(yùn)用已構(gòu)建的CHCHD2野生型及突變型過表達(dá)和表達(dá)抑制單克隆細(xì)胞系,研究突變后細(xì)胞活力、凋亡水平、凋亡蛋白表達(dá)水平、膜電位、活性氧、ATP及細(xì)胞有氧呼吸水平變化。分離并培養(yǎng)突變攜帶患者來源的皮膚成纖維細(xì)胞,研究CHCHD2及相關(guān)蛋白表達(dá)水平變化。6 檢測(cè)CHCHD2突變后磷酸化水平的改變。探討CHCHD2蛋白和RBPJ、COX1、CHCHD10及MICS1蛋白相互作用。檢測(cè)突變攜帶患者來源的皮膚成纖維細(xì)胞中CHCHD10相關(guān)蛋白表達(dá)水平,及線粒體形態(tài)改變。7利用家系內(nèi)CHCHD2T61I突變攜帶患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞,誘導(dǎo)iPS細(xì)胞系并鑒定。利用小鼠胚胎干細(xì)胞打靶技術(shù),構(gòu)建CHCHD2T61I點(diǎn)突變小鼠模型。結(jié)果:1本研究納入的帕金森綜合征家系符合常染色體顯性遺傳規(guī)律。除帕金森癥狀外,先證者有重疊多系統(tǒng)萎縮的臨床特征,另一名家庭成員則表現(xiàn)為特發(fā)性震顫。應(yīng)用全外顯子組捕獲及高通量測(cè)序,結(jié)合后續(xù)生物信息學(xué)分析,我們發(fā)現(xiàn)CHCHD2基因的c.182CT(p.T61I)突變是本家系的致病位點(diǎn)。2 此家系內(nèi)攜帶CHCHD2 c.182CT(p.T61I)突變患者的PET-CT結(jié)果顯示,多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體顯像信號(hào)明顯減低,與臨床嚴(yán)重情況呈負(fù)相關(guān),與散發(fā)性PD患者結(jié)果類似。而其殼核和蒼白球葡萄糖代謝水平明顯增高,這也符合18F-FDG PET-CT的PD相關(guān)模式特點(diǎn)。3 在漢族散發(fā)性PD患者中,我們發(fā)現(xiàn)了 5個(gè)已知的多態(tài)位點(diǎn):c.-11GA、c.-11GA、c.5C＞T、c.51-127GA、c.456+125GA。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析后,位點(diǎn)c.5CT的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(OR= 4.79,95%CI= 1.03-22.26,p = 0.03),其余四個(gè)位點(diǎn)在兩組間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4成功構(gòu)建CHCHD2野生型及突變型真核表達(dá)載體,及篩選出CHCHD2穩(wěn)定過表達(dá)和穩(wěn)定抑制的單克隆細(xì)胞系。CHCHD2蛋白在細(xì)胞應(yīng)激條件下的高表達(dá),T61I突變后蛋白穩(wěn)定性、亞細(xì)胞定位無明顯變化。5與對(duì)照相比,CHCHD2表達(dá)抑制的單克隆細(xì)胞系在細(xì)胞活力、凋亡水平、凋亡蛋白、膜電位、活性氧、ATP及細(xì)胞有氧呼吸水平均受到影響。而在穩(wěn)轉(zhuǎn)過表達(dá)細(xì)胞系中,和野生型蛋白相比,在應(yīng)激條件下,T61I突變后CHCHD2蛋白對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用喪失。在患者來源的皮膚成纖維細(xì)胞中,CHCHD2蛋白及mRNA水平均不改變。6 CHCHD2突變后磷酸化水平未改變。CHCHD2蛋白與CHCHD10蛋白存在相互作用,且CHCHD2突變后與CHCHD10結(jié)合水平更高�；颊邅碓吹钠つw成纖維細(xì)胞中CHCHD10及DRP1蛋白水平降低,CHCHD2與MICS1結(jié)合水平降低。CHCHD2突變患者皮膚成纖維細(xì)胞線粒體形態(tài)嚴(yán)重受損。7 構(gòu)建了患者來源疾病特異性CHCHD2突變型iPS細(xì)胞系,相關(guān)指標(biāo)鑒定正確。構(gòu)建了 CHCHD2T61I點(diǎn)突變小鼠模型,鑒定正確。結(jié)論:1.CHCHD2基因的c.182CT(p.T611)突變是本研究納入的帕金森綜合征家系的致病位點(diǎn),即CHCHD2突變可導(dǎo)致常染色體顯性帕金森綜合征。2.在散發(fā)性PD患者中,CHCHD2多態(tài)位點(diǎn)c.5CT與正常對(duì)照相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明攜帶c.5CT可能增加患PD的風(fēng)險(xiǎn)。3.野生型CHCHD2蛋白對(duì)細(xì)胞具有保護(hù)作用,而T61I突變型CHCHD2蛋白并無細(xì)胞毒性,但是喪失了對(duì)細(xì)胞的保護(hù)功能。4.CHCHD2和CHCHD1O的相互作用可能在發(fā)病過程中起重要作用。5.成功構(gòu)建了患者來源的疾病特異性CHCHD2突變型iPS細(xì)胞系及CHCHD2 T61I點(diǎn)突變小鼠模型。
【圖文】：

圖１－１－１：本研[偰扇氳暮鶴逡糯耘兩鶘酆險(xiǎn)骷蟻低計(jì)族義掀魃璞負(fù)褪約鈴義媳恚椋保樗玫降鬧饕瞧魃璞負(fù)褪約鈴義霞撩棋沃圃歟錚鴣⒘糠止夤舛紉清蚊攔裕瑁澹潁恚鎪俚臀呂胄幕危牛穡穡澹睿洌錚潁嫻雌麇偽本┝灰潛本┝灰牽幔齲椋螅澹瘢玻埃埃案咄坎廡蛞瞧麇蚊攔歟歟歟酰恚椋睿幔簦椋錚鑠澹櫻希希牽厥中酒教ㄥ蚊攔桑歟歟酰恚椋睿嶠灰清蚊攔桑歟歟酰恚椋睿幔徨澹校幔椋潁澹溴澹澹牛睿溴澹牽澹睿錚恚椋沐澹模危鈴澹櫻幔恚校桑邋澹校潁邋澹校耍椋翦迕攔澹桑歟歟酰恚椋睿徨澹幔校幔椋潁澹溴澹澹牛睿溴澹茫歟酰螅簦澹蟈澹牽澹睿澹潁幔簦椋錚鑠澹耍椋簦觶村蚊攔澹桑歟歟酰恚椋睿徨澹玻保埃板澹攏椋镥澹幔睿幔歟冢澹蟈危粒紓椋歟澹睿翦，

本文編號(hào)：2663472