發(fā)布時間：2020-05-14 10:07

【摘要】：目的:腦出血誘導(dǎo)的炎性損傷機制極其復(fù)雜、加重病情、影響預(yù)后。近年來大量研究發(fā)現(xiàn)NF-κB是參與ICH血腫周圍炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。NEMO結(jié)合結(jié)構(gòu)域(NBD)多肽是根據(jù)IKKα、IKKβ羧基末端同源結(jié)構(gòu)域——NBD區(qū)域設(shè)計的一種具有細胞滲透性的多肽,是NF-κB特異性抑制劑,可下調(diào)NF-κB通路活性。本研究擬以C57BL/6j小鼠自體腦出血模型為研究對象,探討NBD多肽在腦出血后的作用以及可能的機制。方法:本研究隨機分為正常對照組、腦出血組、NBD多肽對照組、NBD預(yù)處理+腦出血組(NBD組)、mut-NBD多肽預(yù)處理+腦出血組(mut-NBD多肽組);實驗組小鼠在腦出血模型建立前2小時以1.0mg/kg的劑量側(cè)腦室注射NBD多肽或者mut-NBD多肽;首先利用行為學(xué)實驗——前肢不對稱實驗評估各組小鼠神經(jīng)功能缺損及干濕重法檢測腦組織含水量的變化;然后利用蛋白免疫印跡技術(shù)、ELISA或免疫熒光檢測血腫周圍NF-κB p65、p-IκBα、p-IKKα/β和炎性因子的含量變化以及小膠質(zhì)細胞數(shù)量;最后,在p65 siRNA體內(nèi)轉(zhuǎn)染沉默NF-κB p65情況下給予NBD多肽干預(yù),Western Blot檢測血腫周圍組織p65表達及其磷酸化情況,ELISA檢測炎性因子TNFα變化,行為學(xué)評估神經(jīng)功能損傷情況,明確NBD多肽是否特異性抑制腦出血誘導(dǎo)的NF-κB激活。結(jié)果:NBD多肽明顯降低前肢不對稱評分(p0.001),減少病灶同側(cè)基底節(jié)、皮層腦含水量(p0.01);此外,NBD多肽可抑制p65、IκBα的磷酸化(p0.01),阻止p65的核轉(zhuǎn)位(p0.001),且胞漿p65升高后經(jīng)NF-κB信號通路負反饋上調(diào)IκBα的表達(p0.05);NBD多肽也可減少血腫周圍小膠質(zhì)細胞數(shù)量及其炎性因子的釋放(p0.01);此外,p65 siRNA的存在的情況下NBD多肽不能減少p65的表達及磷酸化(p0.05),但是空白對照siRNA的存在時NBD多肽能減少p65的表達并顯著性抑制其磷酸化(p0.05),且水平高于p65 siRNA存在時。與NBD多肽組相比較,mut-NBD多肽在腦出血后不能發(fā)揮任何神經(jīng)保護作用(p0.05)。結(jié)論:NBD多肽在腦出血后具有改善神經(jīng)功能缺損,減輕腦水腫的作用;NBD多肽可能通過減少血腫周圍IKKα/β、IκBα、NF-κB p65的磷酸化,抑制p65的核轉(zhuǎn)位,促進IκBα的表達,特異性抑制腦出血誘導(dǎo)的NF-κB信號通路的活性發(fā)揮作用,且不影響NF-κB的基礎(chǔ)活性;此外,NBD多肽也可能通過抑制腦出血后小膠質(zhì)細胞的活化和增殖,降低小膠質(zhì)細胞釋放炎性因子,減輕腦出血血腫周圍炎性損傷;由此我們認為NBD多肽可作為一種新型腦出血后抑制灶周炎癥治療藥物的潛在候選者。
【圖文】：

Day3 p=0.0089, con vs. Day5 p=0.076））；抑制蛋白 IκBα 的磷酸化水平明，變化趨勢與 NF-κB p65 水平變化一致，且在腦出血后 48 小時達到峰值, Ipsilateral：F（4，40）=29.88, p<0.0001; Ipsilateral：con vs. Day1 p=0.0009, coy2 p<0.0001, con vs. Day3 p<0.0001, con vs. Day5 p=0.0008）。NF-κB p6κBα 的變化初步表明腦出血后血腫周圍 NF-κB 信號通路激活。為了進一步-κB 信號通路的活性；我們采用 ELISA 檢測作為 NF-κB 信號通路的轉(zhuǎn)錄變化——炎性細胞因子 TNF-α 和 IL-1β。結(jié)果表明腦出血后 TNF-α 和 IL-1著性升高，并且 48 小時變化最明顯（圖 2C, Ipsilateral：F（4，25）=30.28, p<0.0ilateral：con vs. Day1 p=0.0009, con vs. Day2 p<0.0001, con vs. Day3 p<0.0n vs. Day5 p=0.0008; 圖 2D, Ipsilateral：F（4，25）=109.1, p<0.0001; Ipsilateral： Day1 p=0.0156, con vs. Day2 p<0.0001, con vs. Day3 p<0.0001, con vs. D0.00034）。同時我們也檢測了腦出血病灶對側(cè)腦組織的 NF-κB p65、p-IκB性因子的變化，但是與正常對照組相比對側(cè)腦組織變化無統(tǒng)計學(xué)意義。以表明腦出血后炎性損傷在 48 小時最明顯，故本研究中選擇在腦出血建立后時進行實驗。

變化趨勢與 NF-κB p65 水平變化一致，且在腦出血后 48 小時達到峰值（圖2B, Ipsilateral：F（4，40）=29.88, p<0.0001; Ipsilateral：con vs. Day1 p=0.0009, con vs.Day2 p<0.0001, con vs. Day3 p<0.0001, con vs. Day5 p=0.0008）。NF-κB p65 和p-IκBα 的變化初步表明腦出血后血腫周圍 NF-κB 信號通路激活。為了進一步檢測NF-κB 信號通路的活性；我們采用 ELISA 檢測作為 NF-κB 信號通路的轉(zhuǎn)錄因子的變化——炎性細胞因子 TNF-α 和 IL-1β。結(jié)果表明腦出血后 TNF-α 和 IL-1β 均顯著性升高，并且 48 小時變化最明顯（圖 2C, Ipsilateral：F（4，25）=30.28, p<0.0001;Ipsilateral：con vs. Day1 p=0.0009, con vs. Day2 p<0.0001, con vs. Day3 p<0.0001,con vs. Day5 p=0.0008; 圖 2D, Ipsilateral：F（4，，25）=109.1, p<0.0001; Ipsilateral： convs. Day1 p=0.0156, con vs. Day2 p<0.0001, con vs. Day3 p<0.0001, con vs. Day5p=0.00034）。同時我們也檢測了腦出血病灶對側(cè)腦組織的 NF-κB p65、p-IκBα 和炎性因子的變化，但是與正常對照組相比對側(cè)腦組織變化無統(tǒng)計學(xué)意義。以上結(jié)果表明腦出血后炎性損傷在 48 小時最明顯，故本研究中選擇在腦出血建立后 48小時進行實驗。圖 1 NBD 及其突變體的結(jié)構(gòu)NBD多肽由具有細胞穿透性的觸角同源二聚體和 IKKβ 的 T735 至E745 區(qū)域的NEMO結(jié)合
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R743.34

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本文編號：2663191