【摘要】：膠質(zhì)瘤作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腫瘤,具有極強的侵襲性,當前膠質(zhì)瘤患者的治療存在高復(fù)發(fā)率和高死亡率這兩大難題,預(yù)后較差。目前國內(nèi)外公認的膠質(zhì)瘤有效的治療方案是根治性手術(shù)治療配合術(shù)后放化療,但即便接受正規(guī)的內(nèi)外科聯(lián)合治療,其中位生存期也不超過12個月。替莫唑胺(temozolomide,TMZ)作為第二代烷化劑,可通過誘導(dǎo)鳥嘌呤殘基的甲基化從而誘導(dǎo)細胞凋亡,TMZ結(jié)合放療治療膠質(zhì)瘤較單獨放療可明顯改善膠質(zhì)瘤患者預(yù)后,同時具有廣泛的適用性及較小的毒副作用,基于以上優(yōu)點,TMZ已成為膠質(zhì)瘤治療中的標準化療藥物。但僅有不超過一半膠質(zhì)瘤患者對替莫唑胺敏感,機體先天及獲得性耐藥是制約患者對TMZ化療效果的關(guān)鍵原因。因此,尋找一種治療手段能有效抑制膠質(zhì)瘤對TMZ的耐藥性一直是當前神經(jīng)外科領(lǐng)域的焦點和熱點。MicroRNAs(miRNAs)作為一組內(nèi)生的非編碼序列,miRNAs可通過與目的基因3'-UTRs的不完全配對從而誘導(dǎo)目的基因m RNA降解。當前研究發(fā)現(xiàn)miRNAs所調(diào)控的靶基因在包括細胞增長、分化、轉(zhuǎn)移及腫瘤生長在內(nèi)的多種病理生理過程中扮演著重要的角色。近來研究表明miRNAs在腫瘤細胞對化療藥物耐藥中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。例如miR-873可通過靶向調(diào)控Bcl-2從而改善膠質(zhì)瘤對順鉑的耐藥性,而miR-16可通過調(diào)控膠質(zhì)瘤細胞凋亡從而改善膠質(zhì)瘤細胞對TMZ的耐藥性,繼而表明miRNAs可作為一種有效改善膠質(zhì)瘤耐藥性的調(diào)節(jié)劑從而用于膠質(zhì)瘤臨床治療。MiR-497作為一種廣泛存在的miRNA,在大多數(shù)惡性腫瘤中,其可通過抑制細胞增殖和分化從而對腫瘤細胞產(chǎn)生抑制作用。有研究表明miR-497可通過抑制Bcl-2的表達從而誘導(dǎo)乳腺癌細胞凋亡,同時過表達miR-497可抑制體內(nèi)外宮頸癌細胞對順鉑的耐藥性。目前miR-497與膠質(zhì)瘤耐藥性是否存在一定相關(guān)性尚未可知,本次研究將探討miR-497與膠質(zhì)瘤對TMZ的耐藥性的關(guān)系及其可能的作用機制。本研究將從以下四部分進行討論分析:1.人腦膠質(zhì)瘤耐TMZ細胞株的建立及其生物學(xué)特性研究目的:分析不同人腦膠質(zhì)瘤細胞株對TMZ的敏感性,建立體外耐TMZ的膠質(zhì)瘤細胞株,研究膠質(zhì)瘤對TMZ耐藥的分子作用機制以及探討改善膠質(zhì)瘤耐藥的有效方法,從而提高膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后。方法:計算不同膠質(zhì)瘤細胞株(SF295、SHG-44、U138、LN382、U87和U251)對TMZ的半數(shù)抑制濃度(IC50);通過不同濃度梯度的TMZ作用于體外膠質(zhì)瘤細胞,初始劑量為1u M/L,最高劑量為100 u M/L,從而獲得相對穩(wěn)定的耐TMZ細胞株,在光學(xué)顯微鏡下觀察膠質(zhì)瘤細胞生長狀態(tài),計算耐藥細胞株的IC50及耐藥指數(shù)(resistance factor,RF)。結(jié)果:不同膠質(zhì)瘤細胞株(SF295、SHG-44、U138、LN382、U87和U251)對TMZ的IC50分別為54.8、149.6、496.1、349.2、94.8和264.8u M/L,選擇IC50值相對較低的SF295和U87細胞作為后續(xù)實驗研究對象;通過逐步增加TMZ濃度和周期性給藥的方式,在體外成功建立起對TMZ具有穩(wěn)定耐藥性的SF295/TR和U87/TR細胞株,光學(xué)顯微鏡下可見耐藥細胞株較親代細胞體積增大,細胞核呈不規(guī)則形,同時細胞質(zhì)內(nèi)顆粒狀物增加;SF295/TR細胞對TMZ的IC50值較親代SF295細胞增加了6.4倍(分別為465.4±62.8u M/L和72.8±9.2u M/L),U87/TR細胞對TMZ的IC50值較親代U87細胞增加了5.9倍,(分別為645.2±98.1u M/L和108.5±14.8u M/L)。結(jié)論:通過模擬臨床TMZ的用藥程序,成功建立起體外耐TMZ人腦膠質(zhì)瘤細胞株SF295/TR和U87/TR,其耐藥性穩(wěn)定,濃度遞增法是膠質(zhì)瘤細胞產(chǎn)生獲得性耐藥性的重要環(huán)節(jié)。2.MiR-497對體外膠質(zhì)瘤細胞耐藥的影響目的:分析miR-497在耐藥及敏感型膠質(zhì)瘤細胞株中的表達差異,通過上調(diào)及下調(diào)miR-497在敏感及耐藥型膠質(zhì)瘤細胞中的表達,檢測miR-497對體外膠質(zhì)瘤細胞增殖及凋亡的影響,探討miR-497在體外膠質(zhì)瘤細胞耐藥中的機制。方法:檢測miR-497在人正常星形膠質(zhì)細胞系NHA及不同膠質(zhì)瘤細胞株(SF295、SHG-44、U138、LN382、U87和U251)中的表達;分析miR-497在SF295/TR和U87/TR細胞株及其親代細胞株中的表達差異;通過感染pre-miR-497或anti-miR-497至膠質(zhì)瘤細胞,上調(diào)或下調(diào)敏感及耐藥型膠質(zhì)瘤細胞中miR-497的表達,利用CCK-8法檢測miR-497對體外膠質(zhì)瘤細胞增殖的影響,熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡。結(jié)果:與NHA細胞相比較,miR-497在體外膠質(zhì)瘤細胞中的表達均顯著升高,膠質(zhì)瘤細胞株中miR-497的表達與IC50值呈正相關(guān);miR-497在SF295/TR和U87/TR細胞株中的表達較其親代細胞明顯升高;q RT-PCR檢測結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染pre-miR-497后SF295和U87細胞中miR-497表達量較轉(zhuǎn)染前明顯升高,而轉(zhuǎn)染anti-miR-497至SF295/TR和U87/TR細胞后可明顯下調(diào)miR-497表達;上調(diào)miR-497的表達可促進體外SF295和U87細胞增殖,并抑制細胞凋亡;下調(diào)miR-497的表達可抑制體外SF295/TR和U87/TR細胞增殖,并促進細胞凋亡。結(jié)論:(1)MiR-497在膠質(zhì)瘤細胞中的表達強弱與其耐藥程度相一致;(2)MiR-497在膠質(zhì)瘤耐藥細胞中的表達較親代細胞明顯升高;(3)過表達miR-497可促進體外膠質(zhì)瘤細胞增殖,并抑制細胞凋亡,而下調(diào)miR-497的表達可抑制體外膠質(zhì)瘤細胞增殖,同時促進細胞凋亡。3.驗證miR-497潛在靶點及其對體外膠質(zhì)瘤細胞耐藥的作用。目的:尋找miR-497潛在靶點,并探討其潛在靶點對體外膠質(zhì)瘤細胞耐藥中的作用,以期為膠質(zhì)瘤靶向治療開辟新的途徑。方法:通過運用生物信息學(xué)工具RNAhybrid 2.1、Target Scan和Pic Tar對miR-497靶基因進行預(yù)測,western blot法檢測miR-497對體外膠質(zhì)瘤細胞中靶基因蛋白表達的影響;利用CCK-8法檢測靶基因?qū)w外膠質(zhì)瘤細胞增殖的影響,熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡。結(jié)果:運用生物信息學(xué)工具綜合測定mTOR和Bcl-2與has-miR-497存在潛在的結(jié)合位點;western blot實驗證實miR-497可正向調(diào)節(jié)mTOR和Bcl-2在膠質(zhì)瘤細胞中的表達;下調(diào)mTOR和Bcl-2在耐藥膠質(zhì)瘤細胞中的表達可抑制體外膠質(zhì)瘤細胞生長,并促進細胞凋亡。結(jié)論:MiR-497可正向調(diào)節(jié)mTOR和Bcl-2在體外膠質(zhì)瘤細胞中的表達,抑制mTOR和Bcl-2在體外耐藥膠質(zhì)瘤細胞中的表達可逆轉(zhuǎn)膠質(zhì)瘤細胞對TMZ的耐藥性。4.MiR-497對體內(nèi)耐藥型膠質(zhì)瘤細胞生長的影響。目的:通過體內(nèi)實驗,驗證miR-497對體內(nèi)耐藥型膠質(zhì)瘤生長的作用,進一步探究miR-497作為耐藥型膠質(zhì)瘤生物學(xué)靶向治療的可行性。方法:穩(wěn)定轉(zhuǎn)染lenti-anti-miR-497至膠質(zhì)瘤U87/TR細胞株,對照組U87/TR細胞轉(zhuǎn)染lenti-anti-NC;建立裸鼠人腦膠質(zhì)瘤皮下移植瘤模型;通過q RT-PCR檢測miR-497在體內(nèi)膠質(zhì)瘤中的表達;免疫組化法檢測Ki-67在皮下移植瘤組織中的表達;Tunel法檢測腫瘤細胞凋亡;western blot檢測mTOR和Bcl-2的表達。結(jié)果:與對照組相比較,anti-miR-497組皮下移植瘤生長明顯減緩;anti-miR-497組膠質(zhì)瘤中Ki-67的陽性表達率較對照組明顯降低,細胞凋亡明顯增加,同時mTOR和Bcl-2的表達顯著降低。結(jié)論:MiR-497低表達可有效抑制體內(nèi)耐藥型膠質(zhì)瘤生長,miR-497有望成為耐藥型膠質(zhì)瘤治療的作用靶點。綜上所述,本次研究結(jié)果表明miR-497作為一種膠質(zhì)瘤促癌基因,與體內(nèi)外膠質(zhì)瘤對TMZ的耐藥性聯(lián)系密切,同時mTOR和Bcl-2作為miR-497可能潛在靶向基因在膠質(zhì)瘤對TMZ獲得性耐藥中也發(fā)揮了一定作用,從而表明miR-497有望成為膠質(zhì)瘤耐藥的新的治療靶點。
【圖文】：

oRNA-497 通過靶向調(diào)控 mTOR 及 Bcl-2 增強膠質(zhì)瘤對替莫唑胺的耐藥性 第87 細胞作為后續(xù)實驗（圖 1-1A）。表 1：CCK-8 法檢測不同濃度 TMZ 對 6 種膠質(zhì)瘤細胞的增殖抑制作用μ M/L) 0 5 50 100 250 500 1000(OD 值) 1.485±0.357 1.047±0.286 0.915±0.247 0.804±0.248 0.517±0.138 0.377±0.086 0.2614(OD 值) 1.581±0.416 1.286±0.361 1.207±0.249 1.176±0.313 0.954±0.232 0.685±0.127 0.559OD 值) 1.253±0.294 1.181±0.206 1.034±0.253 0.986±0.217 0.964±0.239 0.953±0.274 0.657(OD 值) 1.594±0.342 1.296±0.235 1.196±0.211 1.069±0.234 0.863±0.142 0.847±0.188 0.716D 值) 1.652±0.343 1.428±0.241 1.206±0.249 0.987±0.268 0.876±0.196 0.547±0.113 0.449OD 值) 1.186±0.178 1.034±0.236 0.967±0.312 0.895±0.267 0.879±0.227 0.634±0.176 0.579

1-2：在光學(xué)顯微鏡下觀察親代 SF295 細胞（A）及 SF295/TR 細胞（B）（×42.3 比較耐藥型膠質(zhì)瘤細胞與親代細胞對 TMZ 的 IC50 值培育成功 SF295/TR 和 U87/TR 細胞后，利用 CCK-8 法檢測 TMZ 對兩種細胞殖抑制作用，，檢測結(jié)果如表 2；SF295/TR 和 U87/TR 細胞對 TMZ 的 IC50 分別5.4 和 645.2 uM/L；如圖 1-1B 所示，SF295/TR 和 U87/TR 細胞的 IC50 與各自親胞相比較，差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性（P < 0.001），其 RI 指數(shù)分別為 8.49 和 6.81。表 2：CCK-8 法檢測不同濃度 TMZ 對 SF295/TR 和 U87/TR 細胞的增殖抑制作(μ M/L) 0 5 50 100 250 500 100095/TR (OD 值) 0.927±0.196 0.907±0.246 0.867±0.218 0.843±0.169 0.784±0.158 0.724±0.128 0.531±/TR (OD 值) 1.108 1.086±0.209 1.027±0.186 0.997±0.259 0.968±0.210 0.942±0.185 0.712± 討 論近年來隨著外科手術(shù)器械、顯微外科手術(shù)技巧及神經(jīng)導(dǎo)航技術(shù)的興起和發(fā)展
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R739.4

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