【摘要】：卒中已經(jīng)成為一個(gè)主要的公共健康問題。有效的治療方法的缺失增加了對(duì)新的治療靶點(diǎn)的需要。哺乳動(dòng)物大腦具有自我修復(fù)的能力,從而重新獲取丟失的功能。因此,促進(jìn)再生修復(fù)為卒中提供了一個(gè)新的治療方法,包括神經(jīng)發(fā)生、樹突重構(gòu)和軸突芽生等。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase,nNOS)和突觸后密度蛋白-95(protein postsynaptic density-95,PSD-95)之間的相互作用負(fù)性調(diào)控大鼠卒中后再生修復(fù)。而神經(jīng)元中nNOS-PSD-95解耦聯(lián)則促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)向神經(jīng)元分化,并促進(jìn)新生細(xì)胞向缺血損傷區(qū)遷移,同時(shí)增強(qiáng)卒中后新生神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)和成熟神經(jīng)元樹突棘形成。更有趣的是,nNOS-PSD-95解耦聯(lián)能夠通過促進(jìn)大鼠腦內(nèi)再生修復(fù)從而在恢復(fù)階段改善卒中后運(yùn)動(dòng)功能。由此,nNOS-PSD-95解耦聯(lián)對(duì)腦缺血后神經(jīng)發(fā)生的促進(jìn)作用已經(jīng)明確,但隱藏在其中的機(jī)制仍不清楚。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,表觀遺傳學(xué)能夠調(diào)控NSCs的分化命運(yùn)。而組蛋白乙�；腿ヒ阴；潜碛^遺傳學(xué)機(jī)制中的重要內(nèi)容,分別通過組蛋白�；D(zhuǎn)移酶(histone acetyltransfeases,HATs)和組蛋白去乙�；�(histone deacetylases,HDACs)來(lái)參與基因的激活和抑制;并且組蛋白去乙酰化酶-2(histone deacetylase-2,HDAC2)選擇性表達(dá)在神經(jīng)細(xì)胞譜系,在成年后神經(jīng)發(fā)生以及NSCs分化過程中發(fā)揮著重要作用。由此,我們猜測(cè):在nNOS-PSD-95解耦聯(lián)促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)發(fā)生過程中,HDAC2可能發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。此外,神經(jīng)源性分化蛋白(neurogenic differentiation,NeuroD)是神經(jīng)元特異性的轉(zhuǎn)錄因子;而在NSCs中,HDACs能夠沉默關(guān)鍵神經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá),例如NeuroD。因此,在HDAC2調(diào)控神經(jīng)發(fā)生過程中,NeuroD可能是HDAC2下游的關(guān)鍵效應(yīng)分子。實(shí)驗(yàn)室早期研究發(fā)現(xiàn),在腦缺血梗死周圍區(qū),Best1表達(dá)明顯上調(diào);而抑制HDACs能夠下調(diào)腦缺血后Best1的高表達(dá),即表觀遺傳學(xué)正性調(diào)控腦缺血后Best1表達(dá)。因此,我們猜測(cè):在nNOS-PSD-95解耦聯(lián)通過抑制HDAC2表達(dá)促進(jìn)功能恢復(fù)過程中,Best1可能發(fā)揮著重要作用。綜上,本論文研究了nNOS-PSD-95解耦聯(lián)促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)發(fā)生的表觀遺傳學(xué)機(jī)制:第一章,使用大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,以及神經(jīng)干細(xì)胞或是神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)元共培養(yǎng)的氧糖剝奪(oxygen glucose deprivation,OGD)模型,結(jié)合體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn),研究nNOS-PSD-95解耦聯(lián)是否通過影響HDAC2促進(jìn)腦缺血后NSCs向神經(jīng)元分化。第二章,進(jìn)一步探究在nNOS-PSD-95解耦聯(lián)促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)發(fā)生過程中,HDAC2的下游機(jī)制是否與組蛋白乙�；閷�(dǎo)的神經(jīng)元分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子NeuroD的表達(dá)增加相關(guān)。第三章,使用小鼠光照缺血模型,以及星形膠質(zhì)細(xì)胞的OGD模型,結(jié)合體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn),探索腦缺血后干擾Best1表達(dá)對(duì)運(yùn)動(dòng)功能的影響及其機(jī)制。第一章為了探究腦缺血后神經(jīng)元中nNOS-PSD-95解耦聯(lián)是如何發(fā)揮對(duì)NSCs向神經(jīng)元分化的促進(jìn)作用,首先,我們將研究重點(diǎn)放在了HDAC2上。為了特異性地調(diào)控HDAC2,我們?cè)O(shè)計(jì)了包含HDAC2 shRNA的慢病毒(LV-HDAC2-shRNA),以及選擇性表達(dá)HDAC2的腺病毒(Ad-HDAC2)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示LV-HDAC2-shRNA感染的NSCs向神經(jīng)元分化的能力提高,而Ad-HDAC2感染的NSCs則恰恰相反。大鼠齒狀回(dentate gyrus,DG)微量注射Ad-HDAC2使得BrdU~+/DCX~+細(xì)胞數(shù)明顯減少。由此可知,HDAC2負(fù)性調(diào)控NSCs向神經(jīng)元分化。腦缺血引起nNOS-PSD-95相互作用增加,激活nNOS,從而使神經(jīng)元釋放的NO增加;那么,NO在nNOS-PSD-95耦聯(lián)負(fù)性調(diào)控神經(jīng)發(fā)生過程中又扮演了怎樣的角色呢?首先,我們?cè)贜SCs和神經(jīng)元共培養(yǎng)的OGD模型中使用NO供體和清除劑,證明了NO對(duì)NSCs分化也存在負(fù)性調(diào)節(jié)作用。因此,我們猜想神經(jīng)元誘導(dǎo)產(chǎn)生的NO是不是通過調(diào)節(jié)HDAC2來(lái)影響NSCs的分化命運(yùn)?我們使用NO供體來(lái)模擬神經(jīng)元釋放的NO,發(fā)現(xiàn)NSCs中HDAC2的亞硝基化水平未改變,但HDAC2的蛋白表達(dá)和酶活性明顯上調(diào),NO清除劑得到了相反的結(jié)果,即外源NO確實(shí)能上調(diào)NSCs中HDAC2的表達(dá)。接著我們分別在NSCs和神經(jīng)元共培養(yǎng)的OGD模型中以及NSCs單獨(dú)培養(yǎng)的OGD模型中,檢測(cè)NSCs中HDAC2的蛋白水平和酶活性。我們發(fā)現(xiàn)只有在NSCs和神經(jīng)元共培養(yǎng)的OGD模型中,NSCs中HDAC2的蛋白水平和酶活性才會(huì)上調(diào),且能被NO清除劑逆轉(zhuǎn)。由此可知,OGD后神經(jīng)元誘導(dǎo)產(chǎn)生的NO上調(diào)NSCs中HDAC2的表達(dá)和活性。也就是說(shuō),在腦缺血發(fā)生后,若解除nNOS-PSD-95耦聯(lián),就能使神經(jīng)元釋放的NO減少,從而對(duì)NSCs中的HDAC2產(chǎn)生抑制作用。隨后,我們使用LV-HDAC2-shRNA感染NSCs,接著將其和神經(jīng)元共培養(yǎng),并進(jìn)行OGD操作。結(jié)果表明,OGD導(dǎo)致β-Ⅲ-tubulin~+新生細(xì)胞和多突起新生神經(jīng)元減少,NSCs中HDAC2的敲減能逆轉(zhuǎn)這些結(jié)果。提示在腦缺血后,上調(diào)的HDAC2阻礙了NSCs向神經(jīng)元的分化,抑制HDAC2的上調(diào)則有利于腦缺血后的神經(jīng)修復(fù)。那么nNOS-PSD-95解耦聯(lián)促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)發(fā)生的效應(yīng)是否依賴于對(duì)HDAC2的抑制呢?我們?cè)贜SCs過表達(dá)HDAC2的共培養(yǎng)體系中給予ZL006解除OGD加劇的神經(jīng)元nNOS-PSD-95耦聯(lián),觀察NSCs向神經(jīng)元分化的情況。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),ZL006逆轉(zhuǎn)OGD導(dǎo)致的神經(jīng)元分化減少和突起生長(zhǎng)損傷,而HDAC2過表達(dá)則取消了ZL006的作用。綜上,nNOS-PSD-95解耦聯(lián)通過抑制HDAC2促進(jìn)腦缺血后NSCs向神經(jīng)元分化。第二章組蛋白乙�；瘜�(duì)神經(jīng)發(fā)生至關(guān)重要,并且NeuroD是神經(jīng)元特異性的轉(zhuǎn)錄因子。因此,為了闡明腦缺血后nNOS-PSD-95耦聯(lián)通過HDAC2阻礙NSCs向神經(jīng)元分化的下游機(jī)制,我們重點(diǎn)關(guān)注NeuroD。首先,我們使用NO供體處理NSCs,發(fā)現(xiàn)乙�；M蛋白H4(acetylated histone H4,acety-H4)和NeuroD表達(dá)水平明顯降低,而NO清除劑能夠逆轉(zhuǎn)NO供體的這種作用。同時(shí),HDAC2抑制劑TSA和LV-HDAC2-shRNA帶來(lái)的HDAC2的敲減也可以抵消NO供體對(duì)組蛋白乙�；胶蚇euroD表達(dá)的下調(diào),即NO通過上調(diào)HDAC2來(lái)抑制組蛋白乙�；�,從而沉默NSCs中NeuroD表達(dá)。為了確證上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們?cè)贜SCs敲減HDAC2的共培養(yǎng)體系中進(jìn)行OGD操作,檢測(cè)組蛋白乙酰化水平和NeuroD表達(dá)。如我們所料,OGD使得NSCs中組蛋白乙�；胶蚇euroD表達(dá)降低。同樣地,HDAC2的敲減逆轉(zhuǎn)了OGD帶來(lái)的效應(yīng)。也就是說(shuō),nNOS-PSD-95解耦聯(lián)能通過抑制HDAC2來(lái)升高組蛋白乙�；�,從而促進(jìn)NSCs中NeuroD表達(dá)。綜上所述,我們得到結(jié)論:在腦缺血發(fā)生后,解除nNOS-PSD-95耦聯(lián),能夠減少神經(jīng)元來(lái)源的NO,抑制其上調(diào)NSCs中HDAC2表達(dá)和活性的作用,從而升高組蛋白乙�；�,實(shí)現(xiàn)對(duì)神經(jīng)元分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子NeuroD的表觀遺傳學(xué)調(diào)控,促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生。第三章在nNOS-PSD-95解耦聯(lián)通過抑制HDAC2表達(dá)促進(jìn)功能恢復(fù)過程中,Best1是否發(fā)揮著重要作用?為了解決該問題,在本章節(jié),我們重點(diǎn)研究Best1對(duì)腦缺血后運(yùn)動(dòng)功能的影響。首先,我們發(fā)現(xiàn)在腦缺血后第7 d、10 d,梗死周圍區(qū)Best1表達(dá)明顯增加。為了特異性敲減Best1,我們構(gòu)建了重組腺病毒AAV-Best1-shRNA-GFP,發(fā)現(xiàn)干擾Best1表達(dá)有利于腦缺血后運(yùn)動(dòng)功能改善。Best1的W93C突變會(huì)抑制其離子通道功能,因此我們?cè)O(shè)計(jì)了過表達(dá)突變病毒AAV-Best1~(W93C)-3flag-GFP,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示抑制Best1的離子通道功能有利于腦缺血后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。腦缺血梗死周圍區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)大量激活,其激活的主要標(biāo)志之一是膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)表達(dá)增加,因此我們檢測(cè)了腦缺血梗死周圍區(qū)GFAP的表達(dá)時(shí)程。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示GFAP在腦缺血后第3 d、7d、10 d持續(xù)高表達(dá),并且在造模后第10 d,梗死周圍區(qū)Best1和GFAP共標(biāo)量明顯增加,提示我們星形膠質(zhì)細(xì)胞中的Best1可能在腦缺血延遲期功能恢復(fù)過程中發(fā)揮了重要作用。因此,我們體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞,進(jìn)行OGD操作,發(fā)現(xiàn)GFAP和Best1在造模后48、72 h高表達(dá)。接著,我們又發(fā)現(xiàn)干擾Best1表達(dá)能夠抑制GFAP表達(dá),即抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞激活。文獻(xiàn)報(bào)道,激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞重新分配的Best1能夠介導(dǎo)tonicγ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)釋放,而減小卒中后GABA介導(dǎo)的tonic有利于功能恢復(fù)。再結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們猜想:腦缺血后干擾Best1表達(dá),可能是通過抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞激活,從而抑制其中Best1表達(dá)以及離子通道功能,減少GABA釋放,最終改善腦缺血后運(yùn)動(dòng)功能。文獻(xiàn)報(bào)道,蛋白酶激活受體-1(protease-activated receptor 1,PAR1)的激活能夠促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞中Best1釋放谷氨酸以及GABA等膠質(zhì)遞質(zhì);而單胺氧化酶B(monoamine oxidase B,MAOB)介導(dǎo)了星形膠質(zhì)細(xì)胞中tonic GABA的合成。因此,在本章中,我們檢測(cè)了腦缺血梗死周圍區(qū)PAR1和MAOB的表達(dá)時(shí)程,結(jié)果顯示MAOB在造模后第3 d、7d、10 d持續(xù)高表達(dá),而PAR1只在造模后第7 d高表達(dá),說(shuō)明腦缺血后梗死周圍區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞合成的GABA增加,且Best1釋放GABA能力增強(qiáng),初步驗(yàn)證了我們的猜想。
【圖文】：

圖 1. HDAC2 負(fù)性調(diào)控 NSCs 向神經(jīng)元分化。（A）轉(zhuǎn)染 LV-HDAC2-shRNA、LV-control-shRNA、AD-HDAC2-Fla 或是 AD-Flag 的神經(jīng)干細(xì)胞中 HDAC2 表達(dá)水平的免疫印跡統(tǒng)計(jì)圖（n=4）。（B）轉(zhuǎn)染 LV-HDAC2-shRNA、LV-control-shRNA、AD-HDAC2-Flag 或是 AD-Flag 的神經(jīng)干細(xì)胞用β-Ⅲ-tubulin 標(biāo)記的免疫熒光圖（左側(cè)），以及表示新生神經(jīng)元百分量的柱狀圖（左側(cè)）。（C）在感染了AD-HDAC2-Flag或是AD-Flag的大鼠DG區(qū)標(biāo)記DCX 和 BrdU 的免疫熒光圖，以及表示該區(qū)域新生神經(jīng)元百分量的柱狀圖（n=9）。這些大鼠在病毒注射 24 h后接受 MCAO 造模，在造模后的第 14 天殺鼠標(biāo)記 BrdU/DCX。*p ＜ 0.05，**p＜ 0.01，C 圖使用配對(duì) t 檢驗(yàn)，其它兩組圖使用方差分析。2 OGD 后神經(jīng)元誘導(dǎo)產(chǎn)生的 NO 負(fù)性調(diào)控 NSCs 向神經(jīng)元分化神經(jīng)元 nNOS-PSD-95 耦聯(lián)能夠抑制腦缺血后神經(jīng)發(fā)生；腦缺血引起

南京醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文操作，之后標(biāo)記β-Ⅲ-tubulin。我們發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，DETA/NONOate 處理組β-Ⅲ-tubulin+細(xì)胞比率降低，但經(jīng)過 DETA/NONOate 和 C-PTIO 共同處理后，β-Ⅲ-tubulin+細(xì)胞比率有所上升（圖 2.A，B）；不僅如此，多突起神經(jīng)元數(shù)量占β-Ⅲ-tubulin+細(xì)胞數(shù)比重（圖 2.A，C）以及總突起長(zhǎng)度（圖 2.A，D）都出現(xiàn)了相同的變化趨勢(shì)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，在 NSCs 和神經(jīng)元共培養(yǎng)體系中，OGD后神經(jīng)元誘導(dǎo)產(chǎn)生的 NO 負(fù)性調(diào)控 NSCs 向神經(jīng)元分化。提示在腦缺血發(fā)生后，解除 nNOS-PSD-95 耦聯(lián)使神經(jīng)元釋放的 NO 減少，，從而促進(jìn) NSCs 向神經(jīng)元分化。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R743.3

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 沈坤;陳云;匡雨瓊;李飛;;nNOS-PSD-95解耦聯(lián)劑和加巴噴丁、普瑞巴林孿藥的設(shè)計(jì)合成[J];南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2014年10期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 徐軻;nNOS-PSD-95解耦聯(lián)促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)發(fā)生的表觀遺傳學(xué)機(jī)制研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2019年

本文編號(hào)：2660576