發(fā)布時(shí)間：2020-05-12 15:13

【摘要】：朊病毒病,又稱可傳播性海綿狀腦病,是一類可引起人和動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變的致死性疾病。朊病毒病的致病因子是一種具有致病性的異常朊蛋白,又稱為朊病毒。該蛋白由細(xì)胞內(nèi)正常表達(dá)的朊蛋白發(fā)生蛋白錯(cuò)誤折疊轉(zhuǎn)變而來,具有去污劑不溶性、自我復(fù)制能力和有限的蛋白酶K抗性。朊病毒可引起人類克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease, CJD)、致死性家族性失眠癥(fatal familial insomnia, FFI)、吉斯特曼-斯特勞斯綜合征(Gerstmann-Straussler-Scheinkersyndrome, GSS)以及庫魯病(Kuru)。其中CJD又分為散發(fā)型CJD(sporadic CJD, sCJD)、遺傳型CJD (genetic CJD, gCJD)、醫(yī)源型CJD (iatrogenic CJD, iCJD)和變異型CJD (variant CJD, vCJD)四種。朊病毒亦可感染動(dòng)物,引起麇鹿的慢性消耗性疾病、羊的瘙癢癥、牛的海綿狀腦病(瘋牛病)。朊病毒病的典型神經(jīng)病理學(xué)改變包括腦組織中出現(xiàn)淀粉樣斑塊沉積、海綿狀空泡樣變性、神經(jīng)元丟失及膠質(zhì)細(xì)胞增生。Wnt信號(hào)通路是一種廣泛存在于真核生物中進(jìn)化高度保守的信號(hào)通路。Wnt信號(hào)通路在細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、更新、代謝及遷移等生理過程中起到至關(guān)重要的作用。Wnt信號(hào)通路可被19種Wnt配體所激活,按細(xì)胞中信號(hào)傳導(dǎo)是否有β連環(huán)蛋白(p-catenin)參與,可將其分為經(jīng)典Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路(Wnt/β-catenin信號(hào)通路)和非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路,后者又可分為細(xì)胞極性通路(Planar cell polarity pathway, PCP)和Wnt/Ca2+信號(hào)通路,其中經(jīng)典Wnt信號(hào)通路研究最為廣泛。Wnt信號(hào)通路在神經(jīng)元再生及突觸發(fā)生等生理過程中起到重要的調(diào)節(jié)作用。研究表明,Wnt信號(hào)通路的失調(diào)與許多神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制相關(guān),如阿爾茨海默癥和帕金森病,而在朊病毒病中未見報(bào)道。本研究首先以羊瘙癢因子小鼠適應(yīng)株139A和ME7感染的小鼠腦組織為研究對(duì)象,研究朊病毒感染過程中經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的變化情況。通過Western blot方法檢測(cè)到羊瘙癢因子毒株139A和ME7感染終末期的小鼠腦組織中Ser33,Ser37及Thr4’磷酸化β-catenin的表達(dá)明顯高于正常對(duì)照小鼠。同時(shí)對(duì)經(jīng)典Wnt信號(hào)通路轉(zhuǎn)錄調(diào)控的下游靶基因cyclin D1的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)139A及ME7感染終末期的小鼠腦組織中cyclin D1表達(dá)下調(diào)。提示在朊病毒感染終末期的小鼠腦組織中經(jīng)典Wnt信號(hào)通路被抑制。由于GSK-3p可使β-catenin磷酸化,但GSK-3β的Ser9磷酸化后可使自身失活喪失,因此我們檢測(cè)了GSK-3β和Ser9磷酸化GSK-3β的水平變化,結(jié)果顯示與正常C57BL/6小鼠相比,139A及ME7感染終末期的小鼠腦組織中Ser9磷酸化的GSK-3β與總GSK-3β的比值明顯減低,提示朊病毒感染終末期的小鼠腦組織中GSK-3β的活性明顯增加。通過對(duì)經(jīng)典Wnt信號(hào)通路中的信號(hào)分子Wnt-3和正調(diào)控分子Dvl-3的蛋白表達(dá)水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與正常對(duì)照相比,139A及ME7感染終末期小鼠腦組織中Wnt-3蛋白的表達(dá)下調(diào),而Dvl-3與對(duì)照組小鼠腦組織中的表達(dá)水平相近。應(yīng)用Western blot方法檢測(cè)通路中的負(fù)調(diào)控分子DKK-1蛋白表達(dá)水平發(fā)現(xiàn),139A及ME7毒株感染終末期的C57BL/6小鼠腦組織中DKK-1的蛋白表達(dá)明顯升高。進(jìn)一步應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法在朊病毒感染的小鼠皮層及小腦區(qū)域檢測(cè)到大量的DKK-1陽性細(xì)胞,同時(shí)免疫組織熒光結(jié)果顯示,DKK-1蛋白主要在小鼠神經(jīng)元中表達(dá)。選取感染羊瘙癢因子139A及ME7毒株不同時(shí)間點(diǎn)的小鼠腦組織,檢測(cè)經(jīng)典Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果顯示,在羊瘙癢因子感染的過程中,隨著潛伏期的不斷延長(zhǎng),經(jīng)典Wnt信號(hào)通路逐漸被抑制。本研究隨后又以穩(wěn)定感染朊病毒Chandler毒株的小鼠神經(jīng)瘤細(xì)胞系SMB-S15及經(jīng)硫酸戊聚糖(pentosan sulfate, PS)治療清除prpSc的細(xì)胞對(duì)照SMB-PS為研究對(duì)象。與對(duì)照細(xì)胞SMB-PS相比,SMB-S15細(xì)胞中,靶基因cyclin D1、c-myc及survivin的mRNA水平明顯下降。對(duì)細(xì)胞模型中經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的蛋白變化檢測(cè)顯示,與SMB-PS相比,SMB-S15中Ser33, Ser37, Thr41磷酸化β-catenin的表達(dá)明顯上調(diào),Ser9磷酸化GSK-3p;表達(dá)水平明顯下調(diào),cyclin Dl蛋白表達(dá)明顯下調(diào)。我們對(duì)正調(diào)控分子Wnt-3、Dvl-3及負(fù)調(diào)控因子DKK-1蛋白進(jìn)行了Western blot檢測(cè),結(jié)果顯示,與對(duì)照細(xì)胞SMB-PS相比,SMB-S15細(xì)胞中Wnt-3和Dvl-3的表達(dá)下調(diào)。而SMB-PS細(xì)胞中DKK-1的表達(dá)明顯高于SMB-S15細(xì)胞。本研究分別從體內(nèi)水平和體外水平分別證實(shí)了朊病毒感染中經(jīng)典Wnt/p-catenin信號(hào)通路被抑制。
【圖文】：

為研究對(duì)象，為確�；《靖腥镜模樱停拢樱保导�(xì)胞中ＰｒｐＳｅ的存在，將提取的細(xì)胞逡逑裂解液用終濃度為２５邋＾１３／１１１１＾的蛋白酶１＾邋３７°（：消化１邋ｈ，，然后進(jìn)行Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ逡逑檢測(cè)，一抗為ＰｒＰ特異性單克隆抗體６Ｄｌｌ。如圖８所示，經(jīng)２５＾ｉｇ／ｍＬ蛋白酶Ｋ逡逑消化后，ＳＭＢ－Ｓ１５細(xì)胞中檢測(cè)到可抵抗蛋白酶Ｋ消化的ＰｒｐＳｅ條帶，而ＳＭＢ－ＰＳ逡逑細(xì)胞中無ｈｐｓｅ條帶。逡逑ＰＳ邐Ｓ１５逡逑ＰＫ邐￣－邐＋■邐￣邐￣逡逑＾３邐—巧邋ｋＤａ逡逑ｍｍ逡逑—巧帕３逡逑Ｂ邋＾逡逑Ｈｕｌｌ逡逑楩哪眼＿巧…。逡逑圖８．邋ＳＭＢ－Ｓ１５及ＳＭＢ－ＰＳ細(xì)胞中ＰｒｐＳｔ的檢n,逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋８．邋Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋化＃rP校潁穡櫻澹rP椋睿rP櫻停攏

本文編號(hào)：2660410