發(fā)布時(shí)間：2020-05-12 12:16

【摘要】：背景脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)3型(Spinocerebellar Ataxia Type 3/SCA3)又稱(chēng)馬查多-約瑟夫病(Machado-Joseph disease/MJD),是常染色體顯性遺傳性脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)最常見(jiàn)亞型,在我國(guó)的患病率約為3~5/10萬(wàn)。該病是由位于14q32.1上的ATXN3基因CAG三核苷酸異常重復(fù)擴(kuò)增引起的疾病,是目前已發(fā)現(xiàn)的9種由CAG三核苷酸重復(fù)擴(kuò)增引起疾病中的一種。該病的主要臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性加重的小腦性共濟(jì)失調(diào)、步態(tài)不穩(wěn)、動(dòng)作笨拙,可伴有眼球震顫,吞咽障礙以及感覺(jué)異常等,當(dāng)前尚無(wú)有效的治療方法。SCA3的確切發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,既往的研究表明包涵體形成、蛋白質(zhì)質(zhì)量控制系統(tǒng)功能的異常、神經(jīng)元軸突運(yùn)輸障礙、細(xì)胞氧化應(yīng)激功能障礙、細(xì)胞自噬和凋亡的障礙、線粒體結(jié)構(gòu)和功能的異常等均可能參與了SCA3的發(fā)病。高爾基體是真核細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器,主要參與對(duì)部分脂質(zhì)以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成蛋白質(zhì)的加工、修飾、分類(lèi)、包裝與運(yùn)輸,高爾基體在細(xì)胞尤其是神經(jīng)細(xì)胞的物質(zhì)運(yùn)輸中發(fā)揮重要作用。研究表明高爾基體結(jié)構(gòu)和功能的異常參與了肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)、帕金森病(PD)、阿爾茲海默病(AD)、脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)2型(SCA2)等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病過(guò)程,高爾基體碎裂可能是細(xì)胞凋亡的不可逆病理表現(xiàn)。當(dāng)前,在SCA3發(fā)病過(guò)程中,細(xì)胞高爾基體形態(tài)的變化以及高爾基體是否參與SCA3的發(fā)病過(guò)程鮮有報(bào)道。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)是一類(lèi)與胚胎干細(xì)胞具有類(lèi)似形態(tài)和生物學(xué)功能的細(xì)胞,是由日本科學(xué)家山中彌伸于2006年通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染體細(xì)胞重編程建立。與胚胎干細(xì)胞類(lèi)似,誘導(dǎo)多能干細(xì)胞可在體外進(jìn)一步分化為各類(lèi)組織細(xì)胞,患者來(lái)源的i PSCs可為研究疾病的發(fā)病機(jī)制、藥物篩選、基因編輯和細(xì)胞移植治療提供理想的細(xì)胞模型。本研究通過(guò)檢測(cè)SCA3患者來(lái)源的皮膚成纖維細(xì)胞中ataxin-3蛋白、高爾基體蛋白GM130的表達(dá)情況,初步探討了SCA3患者來(lái)源皮膚成纖維細(xì)胞高爾基體的形態(tài)的變化,并成功的構(gòu)建了患者皮膚成纖維細(xì)胞來(lái)源的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs),為后續(xù)分化獲得患者來(lái)源的神經(jīng)細(xì)胞用于進(jìn)一步探討該病的發(fā)病機(jī)制和藥物篩選等奠定了基礎(chǔ)。目的檢測(cè)SCA3患者皮膚成纖維細(xì)胞中高爾基體形態(tài)的變化,構(gòu)建患者來(lái)源的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)。方法1.采用機(jī)械分離法培養(yǎng)SCA3患者與健康志愿者的皮膚成纖維細(xì)胞;2.CCK8細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒檢測(cè)皮膚成纖維細(xì)胞活力,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平,分別采用配對(duì)t檢驗(yàn)和兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析;3.免疫熒光法標(biāo)記皮膚成纖維細(xì)胞高爾基體蛋白GM130,觀察高爾基體形態(tài),計(jì)數(shù)高爾基體碎裂的細(xì)胞數(shù),χ2檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析;4.Western-blot檢測(cè)皮膚成纖維細(xì)胞ataxin-3,GM130的蛋白表達(dá),采用t檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析;5.透射電鏡驗(yàn)證皮膚成纖維細(xì)胞高爾基體形態(tài)的改變;6.采用仙臺(tái)病毒轉(zhuǎn)染的方法構(gòu)建患者來(lái)源的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs);7.堿性磷酸酶染色、核型分析、免疫熒光、流式細(xì)胞、畸胎瘤形成等鑒定患者來(lái)源的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs);8.毛細(xì)管電泳法檢測(cè)患者來(lái)源的iPSCs中ATXN3基因的表達(dá)情況。結(jié)果1.通過(guò)機(jī)械分離法法成功的建立了SCA3患者與健康志愿者皮膚成纖維細(xì)胞;2.患者來(lái)源的皮膚成纖維細(xì)胞表達(dá)突變的ataxin-3蛋白,與健康志愿者皮膚成纖維細(xì)胞相比活力降低(t=2.889,p=0.045),凋亡增加(t=-5.159,p=0.007),高爾基體碎裂增多(χ2=16.61,p0.01),GM130表達(dá)量降低(t=43.658,p0.01);3.SCA3患者來(lái)源的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)堿性磷酸酶染色陽(yáng)性,具有正常的二倍體核型,高表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物OCT4、Nanog和TRA-1-60,在NOD-SCID小鼠體內(nèi)能成功的分化為具有三胚層結(jié)構(gòu)的畸胎瘤;4.患者來(lái)源的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)攜帶致病的ATXN3基因,CAG三核苷酸重復(fù)次數(shù)未發(fā)生改變。結(jié)論1.SCA3患者來(lái)源的皮膚成纖維細(xì)胞高爾基體發(fā)生碎裂,高爾基體碎裂可能參與了SCA3的發(fā)病過(guò)程,為研究SCA3的發(fā)病機(jī)制提供了新的思路;2.成功的構(gòu)建了SCA3患者來(lái)源的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs),可為進(jìn)一步探討SCA3的發(fā)病機(jī)制等提供理想的細(xì)胞模型。
【圖文】：

圖 1.1 皮膚成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)皮膚成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)。A 圖：皮膚組織塊及其遷移出的原代皮膚成纖維細(xì)胞；B 圖：由皮膚組織塊消化傳代培養(yǎng)的皮膚成纖維細(xì)胞。2.2 SCA3 患者皮膚成纖維細(xì)胞活力降低采用 CCK-8 法檢測(cè) SCA3 患者與健康志愿者第 2、4、6、8、10 代皮膚成纖維細(xì)胞的活力（表 1.1），SCA3 患者的皮膚成纖維細(xì)胞活力隨著傳代次數(shù)的增加其活力快速降低，配對(duì) t 檢驗(yàn)結(jié)果表明 SCA3 患者與健康志愿者細(xì)胞活力有顯著性差異（t=2.889，P=0.045），SCA3 患者皮膚成纖維細(xì)胞活力降低（圖 1.2）。

圖 1.1 皮膚成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)。A 圖：皮膚組織塊及其遷移出的原代皮膚成纖維細(xì)胞；B 圖：織塊消化傳代培養(yǎng)的皮膚成纖維細(xì)胞。 SCA3 患者皮膚成纖維細(xì)胞活力降低采用 CCK-8 法檢測(cè) SCA3 患者與健康志愿者第 2、4、6、8、10 代皮膚胞的活力（表 1.1），SCA3 患者的皮膚成纖維細(xì)胞活力隨著傳代次數(shù)的力快速降低，配對(duì) t 檢驗(yàn)結(jié)果表明 SCA3 患者與健康志愿者細(xì)胞活力有異（t=2.889，P=0.045），SCA3 患者皮膚成纖維細(xì)胞活力降低（圖 1.2
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R744.7

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 魏飛飛;肖涵;胡治平;張海南;王春喻;戴和平;湯建光;;Ataxin-3的亞細(xì)胞定位及其對(duì)細(xì)胞器形態(tài)的影響[J];中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志;2015年03期

2 邢嫵;王小宜;廖鑫鑫;沈璐;廖偉華;;SCA3/MJD與SPG4的彌散加權(quán)成像對(duì)比研究[J];中南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2014年08期

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本文編號(hào)：2660204