【摘要】：背景:神經膠質瘤是最常見的原發(fā)性腦腫瘤,其特征是具有局部彌漫浸潤的高侵襲性,并始終保持較差的預后。然而,目前僅有極少數(shù)可靠的生物標志物可用于預測膠質瘤患者的疾病進程、治療反應和結局。已有研究顯示高端粒酶活性或hTERT啟動子突變與人腦腫瘤的臨床診斷及預后參數(shù)密切相關。有也研究提出,與腫瘤組織病理學和臨床參數(shù)相關聯(lián),hTERT可變剪接體的表達可作為某些癌癥患者的診斷或預后生物標志物。同時,端粒酶也因此成為癌癥治療的一個有吸引力的靶點,并且hTERT可變剪接模式的調節(jié)將是一種治療策略。隨著活性hTERT m RNA轉錄體表達水平下降,端粒酶活性會降低。但hTERT可變剪接體的生物學功能和精確調控機制仍不清楚。研究表明,轉化生長因子-β(TGF-β)和反義寡核苷酸處理改變了hTERT前體mRNA的剪切模式,可以抑制端粒酶活性。另一項研究證實,一種G-四鏈體配體12459可以在A549細胞中將hTERT-FL轉換為β缺失hTERT轉錄體而降低端粒酶活性。在端粒單鏈懸端或c-myc基因啟動子序列中已經廣泛研究了G-四鏈體結構,并且證實了hTERT內含子6含有兩個能夠形成G-四鏈體的富含G的序列。同樣,CX-5461作為rDNA轉錄抑制劑目前處于惡性腫瘤的I期臨床試驗中,據(jù)報道它能強烈地結合和穩(wěn)定G-四鏈體結構并能在體外誘導ATM/ATR,DNA損傷。此外,BRACO-19和TMPyP4作為其他兩種G-四鏈體配體在穩(wěn)定G-鏈體結構及誘導端粒DNA損傷方面被廣泛研究,也具有調節(jié)hTERT可變剪接模式的潛力。因此,我們首先分析hTERT可變剪接體及端粒酶活性對膠質瘤患者診斷及預后評估的價值。然后探究G-四鏈體配體對膠質母細胞瘤細胞系hTERT可變剪接模式的調節(jié)潛能,并進一步研究CX-5461對膠質母細胞瘤細胞的生物學功能。目的:用人膠質瘤樣本及人膠質母細胞瘤細胞系來研究端粒酶逆轉錄酶基因可變剪接的臨床意義及G4鏈配體CX-5461對其調控機制。方法:1、收集、凍存膠質瘤樣本并整理臨床資料與病理資料。2、對收集的膠質瘤樣本及人膠質母細胞瘤細胞系總RNA提取并逆轉錄建立cDNA文庫。3、通過RT-PCR檢測膠質瘤樣本及細胞系hTERT可變剪接體的表達并分析其臨床意義。4、通過TRAP實驗檢測膠質瘤樣本及細胞系端粒酶活性并分析其臨床意義。5、通過免疫蛋白印跡法(Western Blot)檢測膠質母細胞瘤細胞相關蛋白的表達變化。6、通過MTT檢測CX-5461對膠質母細胞瘤細胞的抑制率。7、通過細胞克隆實驗檢測CX-5461對膠質母細胞瘤細胞增殖的影響。8、通過流式細胞術檢測CX-5461對膠質母細胞瘤細胞周期及凋亡的影響。9、通過免疫熒光方法檢測細胞端粒DNA損傷相關蛋白熒光強度。結果:1、RT-PCR結果顯示hTERT-All在所有人類膠質瘤組織和細胞系中均有表達,hTERT-FL mRNA在約86.8%的GBM,73.9%的ODM和42.9%的OAM中可檢測到。在膠質瘤瘤組織中檢測到兩種hTERT可變剪接體(hTERT+β和hTERT-β)。38例GBM病例中有33例,24例ODM中有17例,35例OAM中有15例表達hTERT+β轉錄體,其余31例僅表達出無功能hTERT-β轉錄體。hTERT+β轉錄體與hTERT-FL轉錄體的表達一致。當hTERT+β轉錄體與患者的臨床變量相關聯(lián)時,其存在與患者的年齡,KPS,腫瘤大小和WHO腫瘤等級顯著相關(P0.05)。2、TRAP法檢測96例膠質瘤組織標本,結果顯示38例GBM患者腫瘤組織中有34例(89.5%),23例ODM患者腫瘤組織中有17例(73.9%),35例OAM患者腫瘤組織中16例(45.7%)表現(xiàn)出較高的端粒酶活性。統(tǒng)計分析結果顯示,三種不同組織類型的膠質瘤端粒酶活性與hTERT-FL或hTERT+β轉錄體的表達一致。TA與患者性別或切除范圍無關(P0.05)。而與患者年齡,腫瘤大小,KPS和WHO分級等顯著相關(P0.05)。在年齡50歲的52例患者中有30例(57.7%)端粒酶活性陽性,而年齡≥50歲的44名患者中有37例(84.1%)端粒酶活性陽性。在腫瘤6cm的49例患者中有28例(57.1%)端粒酶活性陽性,而腫瘤≥6cm的47例患者中有39例(83%)端粒酶活性陽性。在KPS75的57例患者中有39例(59.6%)端粒酶活性陽性,而KPS≥75的39例患者中有33例(84.6%)端粒酶活性陽性。3、Kaplan-Meier評估顯示,38例GBM患者表達hTERT+β的3年中位生存期為11.5個月,僅表達hTERT β的3年中位生存期為24個月;TA陽性患者的3年中位生存期為12個月,TA陰性患者的3年中位生存期為25個月。23例ODM患者表達hTERT+β或TA陽性的3年中位生存期為19個月,僅表達hTERT β或TA陰性的3年中位生存期為35個月。35例OAM患者表達hTERT+β的3年中位生存期為28個月,僅表達hTERT β的3年中位生存期為36個月;TA陽性患者的3年中位生存期為29個月,TA陰性患者的3年中位生存期為36個月。對于不同WHO組織級別膠質瘤缺乏hTERT+β轉錄體表達或TA的患者存在顯著的生存獲益(P0.05)。4、RT-PCR結果顯示,CX-5461能夠顯著改變hTERT剪接模式,導致T98G和U251細胞中活化的hTERT+β轉錄體急劇下降(P0.05)。另外兩個G-四鏈體配體TMPyP4和BRACO-19作用不顯著。在T98G和U251細胞中,CX-5461可以導致活化的hTERT+β轉錄體以劑量依賴性方式逐漸減少,并且增加非活性的hTERT-β轉錄體的表達(P0.05)。CX-5461可以劑量依賴性方式導致hTERT-FL表達的顯著降低(P0.05),而對hTERT-All表達沒有明顯影響(P0.05)。5、Western blot結果顯示,CX-5461在T98G和U251細胞中僅能微弱下調hTERT蛋白表達,條帶灰度值統(tǒng)計分析顯示這種調控不具有統(tǒng)計學差異(P0.05)TRAP實驗結果顯示,CX-5461可以以劑量依賴性的方式抑制T98G和U251細胞端粒酶活性。6、MTT結果顯示,濃度為0.05到25μM的CX-5461作用48小時后,T98G,U251對CX-5461表現(xiàn)出顯著的劑量依賴性細胞毒性效應。C6細胞系對CX-5461表現(xiàn)出中等強度的劑量依賴性細胞毒性效應。而HEB細胞對CX-5461表現(xiàn)出的細胞毒性反應很弱。細胞克隆形成實驗結果顯示,與對照組相比,T98G,U251細胞的克隆數(shù)目隨CX-5461藥物濃度的增加而呈梯度顯著減少(P0.05)。7、流式細胞術結果顯示,CX-5461可誘導T98G和U251細胞出現(xiàn)G2/M期阻滯。Western blot結果顯示CX-5461能夠明顯上調p53和p16蛋白的表達,而抑制cyclin D1蛋白的表達。8、流式細胞術結果顯示CX-5461可誘導T98G和U251細胞發(fā)生細胞凋亡。Western blot結果顯示CX-5461能夠顯著降低T98G和U251細胞Bcl-2的表達,同時上調cleaved caspase-3和Bax的活性。9、Western blot結果顯示CX-5461可以誘導T98G和U251細胞γ-H2AX,53BP1和p-ATM表達明顯上調。共聚焦顯微鏡觀察免疫熒光雙染細胞核中DNA損傷反應標志物γ-H2AX和p-ATM結果顯示,CX-5461可以誘導T98G和U251細胞表達γ-H2AX和p-ATM并能與TRF1充分實現(xiàn)共定位,證明細胞DNA損傷反應發(fā)生在端粒DNA上。結論:1、人膠質瘤存在兩種hTERT可變剪接體即hTERT+β和hTERT-β,hTERT+β可變剪接體與hTERT-FL可變剪接體表達一致,并且與高端粒酶活性相一致,有作為提示膠質瘤不良預后的生物標志的潛能。2、G-四鏈體配體CX-5461能夠改變hTERT剪接模式,導致GBM細胞活化的hTERT+β及hTERT-FL表達下降,抑制GBM細胞端粒酶活性。3、G-四鏈體配體CX-5461對GBM細胞具有細胞毒性作用,可引起端粒DNA損傷反應,誘導GBM細胞出現(xiàn)G2/M期阻滯及發(fā)生細胞凋亡。
【圖文】：

All 在所有人類膠質瘤組織和細胞系中均有表達（圖 4.1，圖 4.2然后，我們使用 hTERT-FL mRNA 特有的一對引物，通過使行 PCR 分析。結果顯示，，hTERT-FL mRNA 在約 86.8％的 GBM（ ODM（圖 4.3）和 42.9％的 OAM（圖 4.4）中可檢測到。此外，在 h的 96 膠質瘤組織中，hTERT 可變剪接變體表達被進一步研究。（圖 4.2, 4.3, 4.4），在腫瘤組織中檢測到兩種 hTERT 可變剪接體ERT-β）。然而，在所有人膠質瘤組織或 GBM 細胞系中未檢測到α 38 例 GBM 病例中有 33 例（圖 4.2），24 例 ODM 中有 17 例（M 中有 15 例（圖 4.4）表達 hTERT+β轉錄體，其余 31 例僅表現(xiàn)出轉錄體。我們發(fā)現(xiàn)，hTERT+β轉錄體與 hTERT-FL 轉錄體的表達hTERT +β轉錄體與患者的臨床變量相關聯(lián)時，發(fā)現(xiàn)其存在與患者瘤大小和 WHO 腫瘤等級顯著相關（表 3.1）。這些發(fā)現(xiàn)表明 表達與膠質瘤的迅猛生長相關。

圖 4.2 膠質母細胞瘤腫瘤組織 hTERT 可變剪接體表達Figure 4.2 hTERT alternative splice variant patterns in GBMs. Thirty-three of38 (86.8%) GBM cases exhibited hTERT +β transcript, and the remaining cases onlyexhibited nonfunctional hTERT β transcript. Cases with hTERT +β transcript wereconsistent with the expression of hTERT-FL transcript.
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R739.4

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本文編號：2658637