【摘要】：背景:威爾遜氏癥(WD),ATP7B基因突變引起的罕見(jiàn)的銅代謝障礙的常染色體隱性遺傳病。除肝臟,神經(jīng)癥狀外,較低的骨密度是WD的另一個(gè)最常見(jiàn)的臨床特征,但其潛在的機(jī)制尚未完全了解。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs),有著自我更新、生長(zhǎng)迅速、可分化為身體各組織器官的潛能且與胚胎干細(xì)胞相比沒(méi)有倫理宗教法律的限制等優(yōu)點(diǎn)�；谶@些優(yōu)點(diǎn),摻入基因治療的iPSCs可以通過(guò)體外培養(yǎng)建立一些疾病如威爾遜氏癥的細(xì)胞模型,進(jìn)而為相應(yīng)疾病的治療提供新的思路與方法。目的:探究威爾遜氏癥骨密度低的原因;初步探究威爾遜氏癥低成骨活性的機(jī)制;篩選小分子促進(jìn)威爾遜氏癥的成骨分化。方法:通過(guò)擬胚體(EBs)形成以及添加成骨培養(yǎng)基的方法進(jìn)行正常和WD iPSCs的成骨誘導(dǎo)并通過(guò)熒光實(shí)時(shí)定量以及茜素紅染色從基因型以及表型兩方面比較正常對(duì)照組和威爾遜氏癥組之間成骨表達(dá)是否有差異;通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)分析威爾遜氏癥和正常iPSCs誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞的基因表達(dá)譜,進(jìn)而比較正常對(duì)照組和威爾遜氏癥組之間的差異基因并推測(cè)威爾遜氏癥組的低成骨活性可能是通過(guò)β-catenin途徑影響成骨細(xì)胞分化的,然后進(jìn)一步通過(guò)免疫蛋白印跡和免疫熒光驗(yàn)證上述推測(cè);最后通過(guò)篩選小分子發(fā)現(xiàn)SKL2001這個(gè)小分子化合物可通過(guò)破壞β-catenin/Axin之間的相互作用,穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)β-catenin蛋白。進(jìn)而我們通過(guò)實(shí)時(shí)定量以及免疫蛋白印記、免疫熒光驗(yàn)證SKL2001是否可以促進(jìn)威爾遜氏癥組的成骨分化。結(jié)果:通過(guò)擬胚體(EBs)形成以及添加成骨培養(yǎng)基的方法進(jìn)行正常和WD iPSCs的成骨誘導(dǎo)并得到在成骨分化的所有階段中威爾遜氏癥成骨細(xì)胞中的成骨標(biāo)志物基因的表達(dá)顯著低于正常對(duì)照組,并且威爾遜氏癥成骨細(xì)胞中的礦化水平也顯著低于正常對(duì)照組;通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析得到來(lái)自威爾遜氏癥的成骨細(xì)胞和健康對(duì)照之間β-catenin途徑存在顯著差異,推測(cè)威爾遜氏癥的低成骨活性可能是通過(guò)β-catenin途徑影響成骨細(xì)胞分化的。然后通過(guò)免疫蛋白印記和免疫熒光得到在iPSCs階段以及在成骨誘導(dǎo)各階段,威爾遜氏癥組的β-catenin的總蛋白的表達(dá)略低于正常對(duì)照組β-catenin的總蛋白的表達(dá),以及在成骨誘導(dǎo)7天以及21天時(shí),威爾遜氏癥組的胞核蛋白中β-catenin的表達(dá)也都略低于正常對(duì)照組,進(jìn)而可得到威爾遜氏癥的低成骨活性可能與異常的β-catenin途徑有關(guān);最后通過(guò)查閱文獻(xiàn)篩選出了一個(gè)小分子藥物SKL2001,可通過(guò)破壞β-catenin/axin之間的相互作用,穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)β-catenin蛋白。通過(guò)熒光實(shí)時(shí)定量證明了加入小分子SKL2001處理組成骨細(xì)胞的成骨標(biāo)志性基因的表達(dá)較未加入小分子SKL2001處理組成骨細(xì)胞的成骨標(biāo)志性基因的表達(dá)有升高,通過(guò)免疫蛋白印記以及免疫熒光證明了加入小分子SKL2001處理組成骨細(xì)胞β-catenin的表達(dá)較未加入小分子SKL2001處理組成骨細(xì)胞中的β-catenin的表達(dá)向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)移增加,核蛋白的表達(dá)升高,進(jìn)而激活了下游轉(zhuǎn)錄。但卻沒(méi)有劑量依賴(lài)性。結(jié)論:在本課題中,通過(guò)擬胚體(EBs)形成以及添加成骨培養(yǎng)基的方法進(jìn)行正常和WD iPSCs的成骨誘導(dǎo)并通過(guò)與正常對(duì)照組比較首次發(fā)現(xiàn)了WD-iPSCs衍生的成骨細(xì)胞表現(xiàn)出比正常對(duì)照組更低的成骨活性。進(jìn)一步通過(guò)基因表達(dá)譜的分析,總蛋白和胞核蛋白中β-catenin的檢測(cè)以及β-catenin的核定位情況,我們鑒定并驗(yàn)證了威爾遜氏癥組中低成骨活性可能是由于異常的β-catenin途徑所致。最后,通過(guò)加入小分子SKL2001處理組與未處理組的比較得到小分子SKL2001可以通過(guò)破壞Axin/β-catenin復(fù)合物的形成,促進(jìn)β-catenin的表達(dá)量以及向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)移增加,促進(jìn)威爾遜氏癥組的成骨分化,改善威爾遜氏癥骨密度低的現(xiàn)狀。因此,我們的上述研究結(jié)果表明,威爾遜氏癥患者骨密度低和骨質(zhì)疏松可能是由于異常β-catenin信號(hào)通路引起的成骨減少,這些威爾遜氏癥患者可能受益于β-catenin靶向策略,以改善骨重建的不平衡。
【圖文】：

圖 1 基于 iPSCs 的正常對(duì)照和威爾遜氏癥的成骨誘導(dǎo)Fig.1 Osteogenesis induction from both normal and WD iPSCs was performed(Scale bar represents 500μm)1.2.2 RT-qPCR 檢測(cè)成骨標(biāo)志性基因的表達(dá)正常對(duì)照組的 iPSCs 和威爾遜氏癥的 iPSCs 在經(jīng)過(guò)上述的細(xì)胞培養(yǎng)以及成骨誘導(dǎo)后得到的成骨細(xì)胞，trizol 試劑分別收集兩者定向分化 7 天、14 天以及 21 天的成骨細(xì)胞中的 RNA，并且經(jīng)過(guò) RNA 的提取，cDNA 的逆轉(zhuǎn)錄以及 RT-qPCR 的檢測(cè)，比較兩者的成骨標(biāo)志基因的表達(dá)差異，進(jìn)而初步判斷威爾遜氏癥的骨密度降低是否與成骨有關(guān)。其中control 為正常對(duì)照組，WD 為威爾遜氏癥組。圖 2 為兩者定向分化 7 天、14 天以及 21天時(shí)成骨細(xì)胞成骨標(biāo)志性基因表達(dá)的差異圖，如圖所示，在誘導(dǎo) 7 天的時(shí)候，與正常對(duì)照相比，OCN，RUNX2 以及 COL1A1 在 WD 組成骨標(biāo)志基因的表達(dá)約低 2 倍，在誘導(dǎo)14 天的時(shí)候，ALP 和 RUNX2 在 WD 組成骨標(biāo)志基因的表達(dá)比正常對(duì)照組約低 6 倍，COL1A1 約低 4 倍，雖然 OCN 的差異并沒(méi)有 ALP，RUNX2，以及 COL1A1 的差異大，

T-qPCR 檢測(cè)威爾遜氏癥組以及正常對(duì)照組成骨細(xì)胞的成骨標(biāo)志性基因的-PCR detect the expression of the osteogenic marker gene in the normal contro(*P < 0.05)染色檢測(cè)磷酸鹽堆積組的iPSCs和威爾遜氏癥的iPSCs在經(jīng)過(guò)上述的細(xì)胞培養(yǎng)以及成細(xì)胞，通過(guò)進(jìn)行茜素紅染色，檢測(cè)其礦化能力。結(jié)果如圖 3 所示骨誘導(dǎo) 51 天后礦化結(jié)節(jié)的圖，，下圖為威爾遜氏癥組成骨誘導(dǎo) 51出在同樣的階段時(shí)，正常對(duì)照組相對(duì)于威爾遜氏癥組經(jīng)過(guò)茜素紅顯的紅色的礦化結(jié)節(jié)并且顆粒比較大，密度也比較大，而威爾遜較少近乎沒(méi)有，并且且顆粒較小，由此可看出在礦化末期，健康爾遜氏癥組多且大，即威爾遜氏癥組的礦化水平低于正常對(duì)照。
【學(xué)位授予單位】：濟(jì)南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R742.4

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本文編號(hào)：2657590