【摘要】：目的:構(gòu)建seipin基因全身性敲除小鼠,觀察seipin基因缺失對小鼠生存狀態(tài)及血糖水平的影響,明確seipin基因在小鼠腦內(nèi)各部位的表達(dá)情況,為進(jìn)一步研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)seipin基因缺失的影響提供新的思路。方法:1.在C57BL/6(wild type,WT)小鼠seipin基因序列的第5-8外顯子插入LacZ報告基因和兩側(cè)帶有LoxP位點的Neo抗性基因后與ZP3-Cre小鼠交配產(chǎn)生只含有LacZ報告基因的seipin~(+/-),seipin~(+/-)雌雄小鼠交配產(chǎn)生全身敲除seipin基因的seipin~(-/-)(knockout,KO)小鼠,運(yùn)用半定量PCR鑒定小鼠基因型,實時熒光定量PCR驗證seipin基因敲除率。2.比較不同年齡階段的KO及其同窩對照小鼠體重、體型、存活率及血糖水平。3.通過實時熒光定量PCR評估成年小鼠腦內(nèi)各部位seipin基因的表達(dá)水平;選取成年KO小鼠,制備大腦的冰凍切片,通過LacZ染色準(zhǔn)確定位seipin基因分布部位。4.通過高架O迷宮、黑白箱、曠場實驗檢測成年KO及其同窩對照小鼠的焦慮情緒。結(jié)果:1.WT小鼠與ZP3-Cre小鼠交配產(chǎn)生只含有LacZ報告基因的seipin~(+/-),seipin~(+/-)雌雄小鼠交配后獲得KO小鼠。通過半定量PCR鑒定小鼠基因型,并通過熒光定量PCR驗證小鼠sepin基因敲除效率,結(jié)果顯示seipin~(+/-)小鼠的基因敲除率可達(dá)35.1%(P0.01),而KO小鼠的基因敲除率可達(dá)到95.1%(P0.001),成功構(gòu)建出seipin基因全身性敲除的小鼠模型。2.比較不同年齡KO及其同窩對照小鼠的體型,發(fā)現(xiàn)至5月齡時,幾乎所有KO小鼠均出現(xiàn)明顯肝腫大,但同年齡的WT小鼠未出現(xiàn)這一病理變化。比較不同年齡KO及其同窩對照小鼠的體重,結(jié)果顯示隨年齡增長,WT及KO小鼠體重均有所上升,1月齡、3月齡KO小鼠的體重較同年齡WT小鼠無明顯差異,5月齡及以后,KO小鼠體重較WT小鼠明顯增加,至11月齡時WT及KO小鼠體重均有一定程度下降,但此時KO小鼠體重仍較WT小鼠高。比較KO及其對照小鼠存活率,結(jié)果顯示5月齡之前WT及KO小鼠的存活率基本一致,5月齡至9月齡,WT小鼠生存情況無明顯異常,但此時KO小鼠的存活率會逐漸降低,9月齡之后,WT小鼠存活率略微降低,KO小鼠的存活率則會大大下降。檢測不同年齡小鼠正常飲食的血糖情況,結(jié)果顯示不同年齡WT小鼠血糖水平基本保持穩(wěn)定,KO小鼠血糖隨年齡增長逐漸增高。1月齡KO小鼠血糖已經(jīng)較WT小鼠升高,之后隨年齡增長,KO小鼠與WT小鼠血糖水平差距更加明顯,11月齡KO小鼠血糖水平均略微下降,但仍較同年齡WT小鼠高。3.運(yùn)用熒光定量PCR檢測成年WT小鼠大腦各部位seipin基因表達(dá)水平,結(jié)果顯示小鼠腦內(nèi)seipin基因在海馬的表達(dá)水平最高,皮層和小腦次之,SVZ、杏仁核、下丘腦也均有明顯表達(dá),并且通過LacZ染色可以準(zhǔn)確定位seipin基因在大腦各部位、各核團(tuán)的表達(dá)。4.檢測成年KO小鼠的焦慮情緒,高架O迷宮試驗中,KO小鼠在開放臂停留時間與WT小鼠相比降低33.1%(P0.05),黑白箱實驗中KO小鼠在白箱停留時間較WT小鼠縮短26.4%(P0.05),曠場實驗中KO小鼠在中央?yún)^(qū)停留時間較WT小鼠減少40.5%(P0.05),以上結(jié)果均表明成年KO小鼠已出現(xiàn)明顯的焦慮情緒。結(jié)論:成年KO小鼠出現(xiàn)明顯肝腫大,血糖水平明顯升高,存活率大大下降。小鼠腦內(nèi)seipin基因在海馬的表達(dá)水平最高,皮層和小腦次之,SVZ、杏仁核、下丘腦也均有明顯表達(dá)。另外,成年KO小鼠出現(xiàn)明顯焦慮情緒,但目前尚不能確定焦慮情緒是否與腦內(nèi)seipin基因缺失直接相關(guān),仍需進(jìn)一步驗證。
【圖文】：

山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文在 WT 小鼠 seipin 基因序列的第 5-8 外顯子插入 LacZ 報告基因和兩側(cè)帶有LoxP 位點的 Neo 抗性基因后與 ZP3-Cre 小鼠交配產(chǎn)生只含有 LacZ 報告基因的seipin+/-（圖 1-1），seipin+/-雌鼠與雄鼠交配后產(chǎn)生 WT、seipin+/-、KO 三種小鼠（圖 1-2）。待 1 月齡時剪取鼠尾通過半定量 PCR 鑒定小鼠基因型，只出現(xiàn) 400bp條帶即為 KO 小鼠，只出現(xiàn) 175bp 條帶即為 WT 小鼠，兩者均出現(xiàn)，即為 seipin+/-小鼠（圖 1-3）；另取小鼠腦部海馬及 SVZ 組織，通過實時熒光定量 PCR 驗證基因敲除率，結(jié)果顯示 seipin+/-小鼠 seipin 基因敲除率可達(dá) 35.1%（P<0.01)，，KO小鼠的基因敲除率達(dá)到 95.1%（P<0.001)，成功構(gòu)建全身敲除 seipin 基因的小鼠模型（圖 1-4）。

全身敲除seipin基因小鼠的產(chǎn)生
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R741

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 張興q

本文編號：2654448