【摘要】：研究背景膠質(zhì)瘤(Gliomas)是最常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤,約占成人惡性腫瘤的2%。2007年至2011年,原發(fā)性腦瘤的發(fā)病率為每10萬人21.4例,膠質(zhì)瘤發(fā)病率為每10萬人6.6例,約占顱內(nèi)腫瘤的45%左右,其中約一半為膠質(zhì)母細胞瘤(Glioblastomas)。膠質(zhì)母細胞瘤是一種致命性的疾病,大多數(shù)患者在確診后的15-18個月內(nèi)死亡,只有不到5%的患者可以存活超過5年。即便是在較為有利的臨床試驗人群中,5年生存率也不會超過10%。目前,惡性膠質(zhì)瘤的標準治療方法是最大安全手術(shù)切除、術(shù)后放療,然后輔以替莫唑胺(Temozolomide)的輔助化療。由于惡性膠質(zhì)瘤的侵襲性生長特點,很少能完全切除。術(shù)中熒光引導(dǎo)技術(shù),如5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid,5-ALA),可以提高切除比例,但不能提高惡性膠質(zhì)瘤患者的總體生存率。自20世紀50年代以來,對顱內(nèi)腫瘤患者進行了放射治療,但該技術(shù)發(fā)展緩慢,其特點之一是抗放射治療的膠質(zhì)瘤干細胞。替莫唑胺是目前治療惡性膠質(zhì)瘤最常用的有效的化療藥物,但其結(jié)果取決于 O6-甲基鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶(O6-methylguaninemethyltransferase,MGMT)的啟動子甲基化狀態(tài)。近年來,隨著對膠質(zhì)瘤生物學特征的認識的增加,越來越多的精確靶向治療成為了研究的熱點。但這些研究目前仍處于起步階段,且基本未進行相關(guān)臨床試驗,未來仍有很長的一段路需要走。這一切都迫切的催促著人們探究膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制,尋找建立新的治療靶標。CD300A是CD300家族九位成員之一,是一種60-KD I型跨膜糖蛋白受體,包含胞外IgV樣結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和在其胞質(zhì)尾部的三個經(jīng)典的ITIM基序。許多研究表明CD300A在髓樣和淋巴樣細胞中都起抑制作用。在中性粒細胞中,CD300A能夠抑制CD32a(FcyRIIa)介導(dǎo)的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)產(chǎn)生。CD300A 的活化降低了 Toll樣受體9(Toll-like receptor 9,TLR-9)誘導(dǎo)的促炎介質(zhì)表達。在人成熟B細胞中,CD300A被發(fā)現(xiàn)作為B細胞受體(B-cellreceptor,BCR)介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)(如Ca2+動員)中的負調(diào)節(jié)因子,并且降低CD300A水平促進B細胞增殖。有趣的是,在HIV感染的患者中,B細胞中CD300A的表達水平顯著低于健康個體,表明CD300A在HIV感染的B細胞異常中的作用。CD300A含有的胞質(zhì)區(qū)域內(nèi)的共有的免疫受體酪氨酸抑制基序抑制了 FcεRI介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)和體外人和小鼠MCs的脫粒。另外,CD300A通過Toll樣受體4抑制信號傳導(dǎo)并抑制MCs和巨噬細胞體外生產(chǎn)細胞因子和趨化因子。與野生型(Wird type,WT)小鼠相比,CD300A-/-小鼠顯示出腹腔細菌清除率提高,CLP術(shù)后存活時間延長。類似地,MC缺陷Kitw-sh/W-sh小鼠腹腔注射CD300A-/-的骨髓來源的培養(yǎng)的MCS(BMMCS),相比于腹腔注射WTBMMCS的小鼠,表現(xiàn)出很大改善的細菌清除率和CLP后存活率。表明MCs上的CD300A涉及細菌清除率和存活。人們對CD300A的各方面都知之甚少。雖然明確它屬于一組抑制性免疫受體,在髓系和淋巴譜系細胞表面都有差異表達,但有關(guān)其在細胞分化、抗原呈遞、細胞因子產(chǎn)生、細胞介導(dǎo)的細胞毒性、免疫突觸終止等關(guān)鍵免疫功能中的作用尚不可知。CD300A介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)也是一個非常復(fù)雜的過程,涉及許多的參與者。目前仍需要更多的研究來確定參與CD300A信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的磷酸酶的靶點和獨特的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)成員。研究發(fā)現(xiàn)CD300A參與某些人類疾病的發(fā)生發(fā)展,包括癌癥、病毒感染、敗血癥、自身免疫疾病、炎癥和過敏性疾病。但我們在理解CD300A在疾病中的作用及其作為治療目標的潛力方面仍處于起點。最新的研究表明,CD300A參與血液惡性腫瘤的發(fā)展。與正常CD19+CD10+B細胞祖細胞相比,CD300A與其他標記物一起在急性淋巴細胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia,ALL)中差異表達。CD300A表達水平更高的患者總體存活時間較短,無復(fù)發(fā),提示CD300A可以作為ALL患者臨床分級的一種生物標志物。此外,小鼠遺傳學研究表明,CD300A通過招募SHP-1和SHIP-1校準致癌信號強度,表明CD300A的靶向可能是治療ALL的一種策略。雖然CD300A在實體腫瘤中是否發(fā)揮作用仍不清楚,但是最近的一項研究表明,CD300A與PS的相互作用抑制了NK細胞對腫瘤細胞的殺傷作用。并有多項研究表明,在腫瘤微環(huán)境中,酸性、活性氧和短暫缺氧對腫瘤內(nèi)皮細胞有明顯的脅迫作用,導(dǎo)致PS的再分布和暴露。事實上,在胃癌,卵巢癌和黑素瘤中都檢測到了 PS的表達。最新研究表明,Mn細胞暴露在缺氧狀態(tài)可導(dǎo)致細胞內(nèi)CD300A轉(zhuǎn)錄物的增加,其可在3小時內(nèi)檢測到,并且通過再氧合作用抵消。其恢復(fù)到常氧細胞的表達水平與HIF-la的積累相關(guān)。在髓細胞前體和MDM中也觀察到了響應(yīng)缺氧的CD300A轉(zhuǎn)錄物的增加。并且CD300A的激活調(diào)節(jié)了 Mn細胞中VEGF和CCL20的表達。另外有研究表明CD300A參與了人類Mn細胞中IL-8和MMP9的表達調(diào)節(jié)。缺氧是絕大多數(shù)實體瘤中普遍存在的現(xiàn)象,并與腫瘤的進展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。VEGF的表達與腫瘤內(nèi)血管形成和血管密度分布有關(guān),還可以刺激內(nèi)皮細胞的存活,增殖和遷移;MMP-9涉及腫瘤細胞的遷移過程。這些結(jié)果側(cè)面表現(xiàn)了 CD300A與實體瘤的發(fā)生和發(fā)展存在的聯(lián)系。目的本課題旨在探討CD300A在人類腦膠質(zhì)瘤進展中的作用及機制。方法利用基因表達譜交互分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA)中163例多形性膠質(zhì)母細胞瘤(Glioblastoma multiforme,GBM)樣本和相應(yīng)的207例癌旁組織,以及518例低級別膠質(zhì)瘤(Lower grade glioma,LGG)樣本和相應(yīng)207例癌旁組織的基因表達數(shù)據(jù),分析CD300A mRNA在膠質(zhì)瘤中的表達變化,并探究CD300A在膠質(zhì)瘤中的差異表達具有的生物學意義,例如與患者預(yù)后的相關(guān)性。收集臨床膠質(zhì)瘤組織及正常腦組織樣本,通過實時定量PCR、western blot以及免疫組織化學等實驗方法檢測,CD300A在臨床膠質(zhì)瘤組織及正常腦組織樣本中的表達模式。選用膠質(zhì)瘤細胞系U87和U251作為體外研究細胞模型,通過轉(zhuǎn)染siRNA-CD300A,構(gòu)建CD300A敲低(siCD300A)細胞株。利用CCK8實驗檢測CD300A敲低對細胞增殖的影響。使用Transwell實驗探究CD300A表達下調(diào)對細胞遷移的影響。通過流式細胞術(shù)檢測CD300A敲低對細胞凋亡的影響,并通過western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達變化。最后,深入探究CD300A在膠質(zhì)瘤細胞中發(fā)揮作用所涉及的信號途徑。結(jié)果GEPIA分析結(jié)果表明CD300AmRNA在膠質(zhì)瘤中表達顯著上調(diào)(P0.05),并與膠質(zhì)瘤患者的總生存率呈負相關(guān)(P0.001)。CD300A高表達預(yù)示預(yù)后不良。臨床樣本分析結(jié)果表明,與正常腦組織樣本相比,CD300A在多形性膠質(zhì)母細胞瘤組織中的mRNA及蛋白表達顯著上調(diào)(P0.05)。細胞實驗結(jié)果表明,CD300A的敲低顯著抑制了 U87和U251細胞的增殖能力(P0.05)。并且,CD300A敲低的U87細胞的遷移細胞數(shù)降低至約1/2(P0.05)。此外,CD300A敲低的U87細胞的凋亡率由23.22 ±2.14%明顯增多至55.8±6.73%(P0.01)。CD300A通過調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白的表達誘導(dǎo)細胞凋亡,包括上調(diào)促凋亡蛋白caspase3和Bax的表達。機制研究結(jié)果表明,CD300A的敲低抑制了 AKT的磷酸化,和AKT信號途徑關(guān)鍵下游蛋白P70的表達。結(jié)論及意義本研究發(fā)現(xiàn)CD300A通過AKT信號途徑在膠質(zhì)瘤進展中發(fā)揮促癌作用,在未來可能成為膠質(zhì)瘤治療的潛在靶標。
【圖文】：

圖１邋ＣＤ３００Ａ在多形性膠質(zhì)母細胞瘤（ＧＢＭ）和低級別膠質(zhì)瘤（ＬＧＧ）及其逡逑

圖２邋ＣＤ３００Ａ在膠質(zhì)瘤中高表達》ＣＤ３００Ａ在３１例ＧＢＭ腫瘤組織和５例正常腦組織逡逑（Ｎｏｒｍａ丨）中的ｍＲＮＡ表達（Ａ）和蛋白表達（Ｂ／Ｃ）。ＣＤ３００Ａ在１０例ＧＢＭ腫瘤組織逡逑和２例正常腦組織（Ｎｏｒｍａｌ）中的免疫組織化學染色評分（Ｄ）及圖片（Ｅ）。＊Ｐ＜邋０．０５。逡逑
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R739.41

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本文編號：2654143