【摘要】：第一部分:構(gòu)建一種新型癲癇模型小鼠:表達(dá)Olig1的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞中特異性敲除FGF9目的:利用Cre-Loxp重組酶系統(tǒng)特異性敲除表達(dá)Olig1少突間質(zhì)前體細(xì)胞中的FGF9,建立了一種新的癲癇模型小鼠。方法:(1)使用Cre-Loxp重組酶系統(tǒng)在表達(dá)Olig1的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞中的特異性敲除FGF9,通過PCR擴(kuò)增的方法來鑒定小鼠基因型。(2)記錄及分析小鼠行為學(xué)特征,然后利用腦電圖(EEG)監(jiān)測(cè)進(jìn)一步證實(shí)小鼠癲癇發(fā)作。結(jié)果:(1)利用Cre-Loxp重組酶系統(tǒng),將Olig1-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠與FGF9~(fl/fl)轉(zhuǎn)基因小鼠交配得到FGF9~(fl/+)Olig1-Cre雜合小鼠,然后再與FGF9~(fl/fl)小鼠交配得到FGF9~(fl/fl)Olig1-Cre純合小鼠,即在表達(dá)Olig1的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞中特異性敲除FGF9(FGF9~(fl/fl) Olig1-Cre,CKO~(Olig1))。FGF9~(fl/fl)(F/F)為對(duì)照鼠。通過PCR和Western Blot分別對(duì)CKO~(Olig1)小鼠基因型和蛋白表達(dá)量進(jìn)行驗(yàn)證。(2)對(duì)CKO~(Olig1)小鼠進(jìn)行錄像,觀察到敲除小鼠出現(xiàn)癇樣發(fā)作的異常行為。CKO~(Olig1)小鼠腦電圖(EEGs)監(jiān)測(cè)到明顯異常的癲癇波,而對(duì)照小鼠并沒有監(jiān)測(cè)到癲癇波。CKO~(Olig1)小鼠首次癲癇發(fā)作的時(shí)間為出生后16-30天內(nèi)。同時(shí),CKO~(Olig1)小鼠與同窩對(duì)照F/F小鼠相比體重約輕三分之一,兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(**P0.01)。結(jié)論:通過Cre-Loxp重組酶系統(tǒng)特異性敲除表達(dá)Olig1的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞中FGF9引起了小鼠癲癇發(fā)作,可能FGF9在表達(dá)Olig1的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞中起到了關(guān)鍵作用。我們建立了一種新的癲癇模型小鼠,為癲癇的研究提供基礎(chǔ)條件。第二部分:模型小鼠癲癇發(fā)作的機(jī)制初步研究目的:利用超高效液相質(zhì)譜-色譜聯(lián)用儀、RNA-seq技術(shù)等研究敲除小鼠癲癇發(fā)作的機(jī)制。方法:(1)利用超高效液相質(zhì)譜-色譜聯(lián)用儀測(cè)小鼠皮層和海馬中GABA及Glu濃度,然后利用免疫熒光染色觀察小鼠海馬區(qū)神經(jīng)遞質(zhì)的表達(dá)情況。(2)通過視頻錄像,觀察腹腔注射加巴噴丁藥物前后小鼠癲癇發(fā)作的次數(shù)。(3)利用RNA-seq技術(shù)研究CKO~(Olig1)小鼠和F/F小鼠之間的差異表達(dá)基因(DEGs),然后利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)所得的DEGs進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果:(1)利用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)量CKO~(Olig1)小鼠以及同窩對(duì)照F/F小鼠皮層和海馬中的GABA和Glu的含量。與對(duì)照組相比,我們發(fā)現(xiàn)CKO~(Olig1)小鼠的GABA濃度明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P0.05)。免疫熒光染色結(jié)果示CKO~(Olig1)小鼠海馬CA3區(qū)中GABA和VGAT的表達(dá)顯著降低,而VGLUT1表達(dá)變化無明顯差異。(2)CKO~(Olig1)小鼠腹腔注射加巴噴丁后能夠明顯降低癲癇發(fā)作次數(shù),前后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(**P0.01)。(3)利用RNA-seq技術(shù)分析了CKO~(Olig1)和同窩對(duì)照F/F小鼠海馬的基因表達(dá)譜,共篩選出150個(gè)DEGs,挑選了7個(gè)DEGs進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)大多數(shù)基因的變化趨勢(shì)與RNA-seq結(jié)果相符。其中,G蛋白/腺苷酸環(huán)化酶(Adcy,AC)/cAMP信號(hào)通路在CKO~(Olig1)小鼠的癲癇發(fā)作中發(fā)揮作用。結(jié)論:初步探索表達(dá)Olig1的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞中FGF9的缺失激活了G蛋白/AC/cAMP信號(hào)通路阻斷GABA合成,導(dǎo)致海馬GABA和Glu比例失衡,誘發(fā)小鼠癲癇。并且證實(shí)FGF9在維持GABA的生理水平方面起著關(guān)鍵作用,是一種新的癲癇發(fā)生候選基因。
【圖文】：

利用Cre-Loxp重組酶系統(tǒng)特異性敲除表達(dá)Olig1的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞中FGF9Fig.1ConditionalknockoutofFGF9inoligodendrocyteprogenitorcellsexpressingOlig1bytheCre-Loxprecombinasesystem.A:Aschematic

統(tǒng)計(jì)7-8月齡的CKOOlig1小鼠及同窩對(duì)照F/F小鼠的體重
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R742.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2652356