本文關鍵詞：Salsolinol合成酶的克隆表達及其生物功能的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：帕金森病（Parkinson’s disease, PD）是一種常見于中老年人的中樞神經系統(tǒng)退行性疾病，研究發(fā)現(xiàn)生物體內存在一類由多巴胺（Dopamine，DA）衍生而來的MPTP結構類似物——兒茶酚異喹啉類物質(CAIQs)。Salsolinol（6,7-二羥基-1,2,3,4-四氫異喹啉，Sal）作為一種能在人腦和尿液中檢測到的內源性兒茶酚異喹啉類物質，在一定條件下，它及其衍生物能引起多巴胺能神經元的死亡從而參與PD致病過程。Sal合成酶（Salsolinol synthase）是兒茶酚異喹啉類物質合成代謝過程中的首個關鍵酶，，它是一種催化多巴胺和乙醛生成多巴胺能神經毒性物質Salsolinol的酶，直接影響到Sal及其衍生物在體內的代謝過程。 研究證實Sal合成酶存在于鼠腦中，通過對純化的Sal合成酶進行氨基酸序列分析獲得其氨基酸序列。研究發(fā)現(xiàn)Sal合成酶氨基酸序列與泛素有94.8%的相似性，由此可通對泛素基因定點突變獲取Sal合成酶基因。本文采用PCR技術擴增Sal合成酶基因，將其連接到原核載體pET28a和真核表達載體pcDNA4上，獲得重組質粒，并將其轉化到大腸桿菌BL21和真核HEK細胞中。Sal合成酶基因在細菌和細胞內大量表達，SDS-PAGE電泳結果及Western-blot顯示出分子量約為12KD特異性蛋白質條帶，與Salsolinol合成酶蛋白分子量大小一致。經親和層析分離得到純化的Salsolinol合成酶蛋白。通過三重四級桿串聯(lián)質譜檢測Sal合成酶的催化活性，結果表明過量表達的Sal合成酶體現(xiàn)出較高的活性，證明前期獲得的蛋白基因所表達的蛋白具有Sal合成酶活性。
【關鍵詞】：帕金森病 Salsolinol合成酶 克隆和表達 純化 酶活
【學位授予單位】：北京理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R742.5
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-11
• 第1章 緒論11-24
• 1.1 帕金森病簡介11-15
• 1.1.1 臨床癥狀及病理特征11
• 1.1.2 帕金森病病因11-12
• 1.1.3 帕金森病發(fā)病機制12-15
• 1.2 氧化應激影響內源性神經毒素兒茶酚異喹啉類物質形成的假說15-17
• 1.3 Sal 的生物合成及神經毒性17-20
• 1.3.1 Sal 的生物合成17-18
• 1.3.2 Sal 及其衍生物的神經毒性18-20
• 1.4 Sal 合成酶及其相關研究現(xiàn)狀20-22
• 1.4.1 Pictet-Spengler 酶20
• 1.4.2 Sal 合成酶20-22
• 1.5 本課題研究的意義與目的22-24
• 第2章 實驗部分24-47
• 2.1 實驗試劑與儀器24-26
• 2.1.1 試劑24
• 2.1.2 菌株和質粒24
• 2.1.3 試劑配置24-25
• 2.1.4 實驗儀器25-26
• 2.2 Sal 合成酶穩(wěn)定表達體系的建立26-36
• 2.2.1 Sal 合成酶基因的獲取26-28
• 2.2.2 原核表達體系的構建28-33
• 2.2.3 真核表達體系的構建33-36
• 2.3 Sal 合成酶的表達及純化36-44
• 2.3.1 原核表達體系蛋白表達36
• 2.3.2 真核表達體系蛋白表達36-38
• 2.3.3 表達蛋白 Sal 合成酶的驗證38-42
• 2.3.4 Sal 合成酶的分離和純化42-44
• 2.4 Sal 合成酶酶活測定44-47
• 2.4.1 Sal 合成酶反應體系及反應條件44-45
• 2.4.2 Sal 催化產物 Sal 的 LC-ESI-QQQ 檢測方法45-47
• 第3章 結果與討論47-57
• 3.1 Sal 合成酶基因克隆47-50
• 3.1.1 定點突變47-48
• 3.1.2 Sal 合成酶基因擴增48
• 3.1.3 重組質粒的構建與分析48-49
• 3.1.4 基因測序與序列分析49-50
• 3.2 Sal 合成酶的表達與純化50-54
• 3.2.1 誘導表達融合蛋白50
• 3.2.2 融合蛋白的純化50-51
• 3.2.3 融合蛋白切除 His 標簽51-52
• 3.2.4 Western-blot 驗證52-54
• 3.3 Sal 合成酶酶活檢測54-57
• 結論57-58
• 參考文獻58-71
• 攻讀學位期間發(fā)表論文與研究成果清單71-72
• 致謝72

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 馬春,鄭長民,王愛民;Parkinson病遺傳學研究進展[J];國外醫(yī)學.遺傳學分冊;2005年04期

2 陳薛釵;王睿;毛健;叢珍珍;林漢斌;鄧玉林;;Salsolinol合成酶的高效液相色譜-電化學活性檢測方法研究[J];化學通報;2010年10期

3 王冉;慶宏;鄧玉林;;內源性兒茶酚異喹啉神經毒性物質參與帕金森病的研究進展[J];神經解剖學雜志;2008年01期

  本文關鍵詞：Salsolinol合成酶的克隆表達及其生物功能的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：265151