本文關(guān)鍵詞：Salsolinol合成酶的克隆表達(dá)及其生物功能的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：帕金森�。≒arkinson’s disease, PD）是一種常見于中老年人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，研究發(fā)現(xiàn)生物體內(nèi)存在一類由多巴胺（Dopamine，DA）衍生而來的MPTP結(jié)構(gòu)類似物——兒茶酚異喹啉類物質(zhì)(CAIQs)。Salsolinol（6,7-二羥基-1,2,3,4-四氫異喹啉，Sal）作為一種能在人腦和尿液中檢測(cè)到的內(nèi)源性兒茶酚異喹啉類物質(zhì)，在一定條件下，它及其衍生物能引起多巴胺能神經(jīng)元的死亡從而參與PD致病過程。Sal合成酶（Salsolinol synthase）是兒茶酚異喹啉類物質(zhì)合成代謝過程中的首個(gè)關(guān)鍵酶，，它是一種催化多巴胺和乙醛生成多巴胺能神經(jīng)毒性物質(zhì)Salsolinol的酶，直接影響到Sal及其衍生物在體內(nèi)的代謝過程。 研究證實(shí)Sal合成酶存在于鼠腦中，通過對(duì)純化的Sal合成酶進(jìn)行氨基酸序列分析獲得其氨基酸序列。研究發(fā)現(xiàn)Sal合成酶氨基酸序列與泛素有94.8%的相似性，由此可通對(duì)泛素基因定點(diǎn)突變獲取Sal合成酶基因。本文采用PCR技術(shù)擴(kuò)增Sal合成酶基因，將其連接到原核載體pET28a和真核表達(dá)載體pcDNA4上，獲得重組質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21和真核HEK細(xì)胞中。Sal合成酶基因在細(xì)菌和細(xì)胞內(nèi)大量表達(dá)，SDS-PAGE電泳結(jié)果及Western-blot顯示出分子量約為12KD特異性蛋白質(zhì)條帶，與Salsolinol合成酶蛋白分子量大小一致。經(jīng)親和層析分離得到純化的Salsolinol合成酶蛋白。通過三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)Sal合成酶的催化活性，結(jié)果表明過量表達(dá)的Sal合成酶體現(xiàn)出較高的活性，證明前期獲得的蛋白基因所表達(dá)的蛋白具有Sal合成酶活性。
【關(guān)鍵詞】：帕金森病 Salsolinol合成酶 克隆和表達(dá) 純化 酶活
【學(xué)位授予單位】：北京理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R742.5
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-11
• 第1章 緒論11-24
• 1.1 帕金森病簡(jiǎn)介11-15
• 1.1.1 臨床癥狀及病理特征11
• 1.1.2 帕金森病病因11-12
• 1.1.3 帕金森病發(fā)病機(jī)制12-15
• 1.2 氧化應(yīng)激影響內(nèi)源性神經(jīng)毒素兒茶酚異喹啉類物質(zhì)形成的假說15-17
• 1.3 Sal 的生物合成及神經(jīng)毒性17-20
• 1.3.1 Sal 的生物合成17-18
• 1.3.2 Sal 及其衍生物的神經(jīng)毒性18-20
• 1.4 Sal 合成酶及其相關(guān)研究現(xiàn)狀20-22
• 1.4.1 Pictet-Spengler 酶20
• 1.4.2 Sal 合成酶20-22
• 1.5 本課題研究的意義與目的22-24
• 第2章 實(shí)驗(yàn)部分24-47
• 2.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器24-26
• 2.1.1 試劑24
• 2.1.2 菌株和質(zhì)粒24
• 2.1.3 試劑配置24-25
• 2.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器25-26
• 2.2 Sal 合成酶穩(wěn)定表達(dá)體系的建立26-36
• 2.2.1 Sal 合成酶基因的獲取26-28
• 2.2.2 原核表達(dá)體系的構(gòu)建28-33
• 2.2.3 真核表達(dá)體系的構(gòu)建33-36
• 2.3 Sal 合成酶的表達(dá)及純化36-44
• 2.3.1 原核表達(dá)體系蛋白表達(dá)36
• 2.3.2 真核表達(dá)體系蛋白表達(dá)36-38
• 2.3.3 表達(dá)蛋白 Sal 合成酶的驗(yàn)證38-42
• 2.3.4 Sal 合成酶的分離和純化42-44
• 2.4 Sal 合成酶酶活測(cè)定44-47
• 2.4.1 Sal 合成酶反應(yīng)體系及反應(yīng)條件44-45
• 2.4.2 Sal 催化產(chǎn)物 Sal 的 LC-ESI-QQQ 檢測(cè)方法45-47
• 第3章 結(jié)果與討論47-57
• 3.1 Sal 合成酶基因克隆47-50
• 3.1.1 定點(diǎn)突變47-48
• 3.1.2 Sal 合成酶基因擴(kuò)增48
• 3.1.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與分析48-49
• 3.1.4 基因測(cè)序與序列分析49-50
• 3.2 Sal 合成酶的表達(dá)與純化50-54
• 3.2.1 誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白50
• 3.2.2 融合蛋白的純化50-51
• 3.2.3 融合蛋白切除 His 標(biāo)簽51-52
• 3.2.4 Western-blot 驗(yàn)證52-54
• 3.3 Sal 合成酶酶活檢測(cè)54-57
• 結(jié)論57-58
• 參考文獻(xiàn)58-71
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文與研究成果清單71-72
• 致謝72

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 馬春,鄭長民,王愛民;Parkinson病遺傳學(xué)研究進(jìn)展[J];國外醫(yī)學(xué).遺傳學(xué)分冊(cè);2005年04期

2 陳薛釵;王睿;毛健;叢珍珍;林漢斌;鄧玉林;;Salsolinol合成酶的高效液相色譜-電化學(xué)活性檢測(cè)方法研究[J];化學(xué)通報(bào);2010年10期

3 王冉;慶宏;鄧玉林;;內(nèi)源性兒茶酚異喹啉神經(jīng)毒性物質(zhì)參與帕金森病的研究進(jìn)展[J];神經(jīng)解剖學(xué)雜志;2008年01期

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本文編號(hào)：265151