【摘要】：研究背景神經(jīng)病理性疼痛是一項(xiàng)重要的公共衛(wèi)生問題,因?qū)ζ浒l(fā)病機(jī)制研究的局限,目前臨床治療效果差。表觀遺傳調(diào)控神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的重要分支,研究表明DNA甲基化影響神經(jīng)病理性疼痛的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)背根神經(jīng)節(jié)(Dorsal root ganglion,DRG)中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3a(DNA methyltransferases 3a,DNMT3a)的升高,可負(fù)調(diào)控μ阿片受體(Mu opioid receptor,MOR)和門控鉀離子通道Kv1.2(voltage-gated potassium channels subunit Kcna2,Kv1.2)的表達(dá),誘發(fā)神經(jīng)元興奮增加,是神經(jīng)病理性疼痛產(chǎn)生的重要外周機(jī)制。我們通過研究坐骨神經(jīng)慢性壓迫損傷模型發(fā)現(xiàn)DRG八聚體轉(zhuǎn)錄因子1(Octamer transcription factor1,OCT1)表達(dá)增加;抑制OCT1表達(dá)可緩解大鼠疼痛行為。通過生物信息學(xué)預(yù)測OCT1可結(jié)合DNMT3a基因啟動(dòng)子區(qū),由此我們提出假說:OCT1促進(jìn)DNMT3a轉(zhuǎn)錄,上調(diào)MOR和Kv1.2基因的啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平,抑制MOR和Kv1.2的表達(dá),參與神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生和慢性化,為神經(jīng)病理性疼痛治療提供新的理論依據(jù)。研究目的探討OCT1是否參與神經(jīng)病理性疼痛的調(diào)控及其作用機(jī)制。研究方法(1)制備大鼠坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷(Chronic construction injury,CCI)模型,檢測OCT1在CCI大鼠DRG中轉(zhuǎn)錄和表達(dá)情況,OCT1在大鼠DRG中定位及與疼痛相關(guān)分子的共標(biāo)情況,研究OCT1與神經(jīng)病理性疼痛的關(guān)系。(2)研究DRG中OCT1對大鼠神經(jīng)病理性疼痛的影響。I:抑制大鼠DRG中OCT1是否影響大鼠神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生:應(yīng)用DRG顯微注射技術(shù),先對大鼠DRG顯微注射OCT1 siRNA,再制備CCI模型,觀察大鼠機(jī)械縮足閾值、熱縮足潛伏期、冷縮足潛伏期等疼痛行為和運(yùn)動(dòng)功能的變化。II:抑制CCI大鼠DRG中的OCT1表達(dá)是否影響大鼠神經(jīng)病理性疼痛的維持:先制備大鼠CCI模型,再行大鼠DRG顯微注射OCT1siRNA,觀察大鼠疼痛行為變化。III:過表達(dá)大鼠DRG中的OCT1對大鼠神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生發(fā)展的影響:采用腺相關(guān)病毒載體rAAV5對大鼠DRG顯微注射rAAV5-OCT1,過表達(dá)大鼠DRG中OCT1,然后觀察大鼠疼痛行為的變化。(3)探討DRG中OCT1對神經(jīng)病理性疼痛調(diào)控的機(jī)制。I:采用用qRT-PCR、Western Blot方法檢測第(2)部分各實(shí)驗(yàn)組大鼠DRG中OCT1、DNMT3a、MOR、Kv1.2的mRNA和蛋白含量,驗(yàn)證在體抑制CCI大鼠DRG中OCT1表達(dá)能否下調(diào)DNMT3a的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),并增加CCI大鼠DRG中MOR和Kv1.2的轉(zhuǎn)錄和表達(dá);過表達(dá)大鼠DRG中OCT1能否上調(diào)DNMT3a的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),下調(diào)MOR的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。II:驗(yàn)證抑制DRG中OCT1表達(dá)上調(diào)是否能夠提高嗎啡的鎮(zhèn)痛效果,確認(rèn)大鼠DRG中OCT1參與神經(jīng)病理性疼痛通過下游分子MOR的功能。結(jié)果1.CCI引起外周神經(jīng)損傷后,大鼠受損DRG中OCT1表達(dá)從術(shù)后3天升高,一直持續(xù)至術(shù)后14天。2.OCT1在大鼠DRG中大、中、小細(xì)胞中均有分布,且主要分布在大、中細(xì)胞中。OCT1與神經(jīng)元核抗原(NeuN),谷氨酰胺合成酶(GS)共標(biāo);OCT1與神經(jīng)絲蛋白-200(NF200),生物素化植物凝集素B4(IB4)、基因相關(guān)肽(CGRP)共標(biāo)。3.DRG中預(yù)先注射OCT1 siRNA能夠阻斷CCI誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生神經(jīng)病理性疼痛的癥狀。CCI術(shù)后采用siRNA基因敲減的方法降低大鼠DRG中OCT1的表達(dá)能夠緩解大鼠CCI引起的痛敏癥狀。4.DRG中升高OCT1的表達(dá)能夠誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生對機(jī)械刺激和溫度刺激的痛覺過敏癥狀。5.無論DRG顯微注射技術(shù)、siRNA基因敲減還是rAAV5載體過表達(dá)均不影響大鼠的運(yùn)動(dòng)功能。6.CCI能夠引起受損DRG內(nèi)OCT1和DNMT3a的mRNA與蛋白含量升高,MOR和Kv1.2的mRNA與蛋白水平下降。抑制OCT1的表達(dá)能夠下調(diào)CCI引起的DNMT3a的高表達(dá)同時(shí)上調(diào)MOR和Kv1.2的表達(dá)。模擬神經(jīng)病理性疼痛中DRG內(nèi)OCT1的高表達(dá)能夠上調(diào)DRG內(nèi)DNMT3a的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)并下調(diào)MOR和Kv1.2的mRNA和蛋白水平。7.OCT1能夠與DNMT3a、MOR及Kv1.2共表達(dá)于DRG細(xì)胞中。8.DRG內(nèi)基因敲減OCT1可以阻止DNMT3a對MOR和Kv1.2的調(diào)控作用。9.OCT1調(diào)控CCI引起的神經(jīng)病理性疼痛最終是通過MOR和Kv1.2的功能,并造成中樞敏化。結(jié)論背根神經(jīng)節(jié)中轉(zhuǎn)錄因子OCT1可轉(zhuǎn)錄激活DNMT3a,促進(jìn)DNMT3a表達(dá),間接負(fù)調(diào)控下游分子MOR和Kv1.2,參與神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生和維持。
【圖文】：

在非手術(shù)側(cè) L4/5 DRG 內(nèi)的蛋白表達(dá)量無明顯變化，說明 OCT1 在大鼠非手術(shù)側(cè)的 DRG 中表達(dá)不受影響。圖1.1 大鼠CCI手術(shù)后OCT1在同側(cè)和對側(cè)L4/5 DRG內(nèi)的表達(dá)情況。A：CCI側(cè)Western Blot結(jié)果中 OCT1 和內(nèi)參蛋白 H3 的顯影條帶。B：采用 H3 為內(nèi)參蛋白，與 Day0 比較，CCI 側(cè)與非 CCI 側(cè) OCT1 條帶蛋白的灰度值對比分析。*P < 0.05 或 **P < 0.01 vs. Day 0 值。2. CCI 手術(shù)不影響 OCT1 在大鼠手術(shù)側(cè)脊髓內(nèi)的表達(dá)我們進(jìn)一步檢測了大鼠 CCI 手術(shù)后 OCT1 在手術(shù)側(cè) L4/5 節(jié)段脊髓背角中的表達(dá)情況。如下圖 1.2，CCI 大鼠手術(shù)側(cè) L4/5 脊髓內(nèi)節(jié)段內(nèi) OCT1 的蛋白含量在各時(shí)間點(diǎn)并無明顯差異。圖 1.2 CCI 術(shù)后 OCT1 在同側(cè) L4/5 脊髓內(nèi)的表達(dá)情況。

OCT1在同側(cè)和對側(cè)L4/5 DRG內(nèi)的表達(dá)情況。A：白 H3 的顯影條帶。B：采用 H3 為內(nèi)參蛋白，與帶蛋白的灰度值對比分析。*P < 0.05 或 **P < 0 OCT1 在大鼠手術(shù)側(cè)脊髓內(nèi)的表達(dá)了大鼠 CCI 手術(shù)后 OCT1 在手術(shù)側(cè) L4/5 節(jié).2，CCI 大鼠手術(shù)側(cè) L4/5 脊髓內(nèi)節(jié)段內(nèi) OC異。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R741

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本文編號：2650539