發(fā)布時間：2020-04-29 20:10

【摘要】：[目的]探討百日咳毒素(pertussis toxin,PTx)對缺血性腦卒中后小膠質(zhì)細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用及其可能的機制。[方法]分為體外、體內(nèi)兩部分實驗。體內(nèi)部分:建立小鼠大腦中動脈線栓(Middle Cerebral Artery Occlusion,MACO)卒中模型,隨機分為三組,每組12只鼠。治療組:建立卒中模型后,予PTx400ng/d,溶于lml生理鹽水腹腔注射干預(yù),連續(xù)干預(yù)三天;對照組:建立卒中模型后,每日予lml生理鹽水腹腔注射;假手術(shù)組:每日予lml生理鹽水腹腔注射。分別在24、48和72h進(jìn)行行為學(xué)評分,統(tǒng)計分析小鼠神經(jīng)功能的損傷和修復(fù)情況。72h進(jìn)行TTC染色檢測梗死面積,并行免疫組化檢測細(xì)胞凋亡及小膠質(zhì)細(xì)胞的分布和激活,同時,采用Western blot實驗定量檢測細(xì)胞凋亡及小膠質(zhì)細(xì)胞。體外部分:培養(yǎng)原代小膠質(zhì)細(xì)胞,用脂多糖(LPS)刺激模擬卒中后小膠質(zhì)細(xì)胞狀態(tài)。隨機分為三組,治療組:LPS刺激后予PTx50ng/ml/d進(jìn)行干預(yù),連續(xù)干預(yù)三天;對照組:LPS刺激后每日予相同體積細(xì)胞培養(yǎng)基,正常對照組:每日予相同體積細(xì)胞培養(yǎng)基。用MTT及SRB實驗檢測百日咳毒素對卒中后小膠質(zhì)細(xì)胞的存活和損傷的調(diào)節(jié)。ELISA實驗檢測百日咳毒素對卒中后小膠質(zhì)細(xì)胞毒性因子釋放的影響;細(xì)胞免疫熒光法檢測百日咳毒素對卒中后小膠質(zhì)細(xì)胞CX3CR1表達(dá)的調(diào)節(jié)。[結(jié)果]百日咳毒素治療可減輕卒中后小鼠腦梗死面積,使之由52±12%降至34±8%(P0.05),并且可以加快神經(jīng)功能損傷的修復(fù),在72h時,LONGA評分由2.2分降至1.8分,而對照組僅由2.3分降至2.2分。免疫組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)百日咳毒素可減輕腦卒中細(xì)胞凋亡,使Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)由對照組的83± 18個/mm2減少至52 ± 16個/Mm2(P0.05)。免疫組織化學(xué)檢測還發(fā)現(xiàn)百日咳毒素還可減少小膠質(zhì)細(xì)胞在梗死區(qū)的聚集和活化,Ibal陽性細(xì)胞數(shù)由對照組的 183±46 個/m2減少至 63±22 個/mm2(P0.05)。Western blot 也得到了與免疫組化實驗一致的結(jié)果,在患側(cè)鼠腦內(nèi),百日咳毒素的治療顯著降低了Caspase-3 的表達(dá),條帶灰度由 1.2±0.2 降至 0.78±0.06(p0.05)。PTx的治療也減少了小膠質(zhì)細(xì)胞在梗死區(qū)的聚集,條帶灰度由1.1 ±0.16降至0.79±0.09(p0.05)。體外MTT結(jié)果提示百日咳毒素減少LPS刺激后小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖,吸光值由0.151±0.001降至0.088±0.001(P0.05);SRB的檢測也得出相似的結(jié)果,百日咳毒素治療后,吸光值由0.462±0.018降至0.426±0.02。ELISA實驗結(jié)果顯示:PTx還可減少IL-1β和TNF-α的釋放,使吸光值分別由0.165±0.001降至0.091±0.0004和0.75±0.003降至0.46±0.005(P0.05)。并且PTx可減少CX3CR1在小膠質(zhì)細(xì)胞上的表達(dá),免疫熒光實驗顯示百日咳毒素治療后,小膠質(zhì)細(xì)胞CX3CR1表達(dá)的熒光強度減弱,由 0.043±0.003 降低至 0.025±0.003(p0.05)。Western blot 結(jié)果也提示CX3CR1 的表達(dá)降低,灰度值由 0.38±0.05 降至 0.29±0.04(p0.05)。[結(jié)論]用百日咳毒素治療腦卒中,可通過降低趨化因子CX3CR1的表達(dá),減少小膠質(zhì)細(xì)胞在梗死區(qū)的聚集,減弱增殖能力,減少其對IL-1β和TNF-α的分泌,使卒中后腦梗面積縮小,神經(jīng)功能恢復(fù)加快,對腦起到保護(hù)作用。
【圖文】：

ＤＴＴ邋３．邋ｌｇ、Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ邋Ｂｌｕｅ邋４－６ｍｇ邋混勻后存于邋４°Ｃ。逡逑２、方法逡逑２．１、實驗動物逡逑Ｃ５７ＢＬ６小鼠，雄性，８周大，重約２０－２５ｇ。購于北京華阜康生物科技股份有逡逑限公司。實驗動物飼養(yǎng)在恒溫（２２土１°Ｃ邋），有規(guī)律的光照（１２ｈ白天，１２ｈ黑天）逡逑的實驗動物房內(nèi)，所有的實驗動物在手術(shù)前后均可以自由獲取食物和水。逡逑出生７２ｈ內(nèi)的Ｃ５７ＢＬ６小鼠，雌雄不限、體重不限，用于小膠質(zhì)細(xì)胞的原代逡逑培養(yǎng)。實驗動物飼養(yǎng)在恒溫（２２土１°Ｃ邋），有規(guī)律的光照（１２ｈ白天，１２ｈ黑天）逡逑的實驗動物房內(nèi)。逡逑２．邋２、大腦中動脈線栓法（Ｍｉｄｄｌｅ邋Ｃｅｒｅｂｒａｌ邋Ａｒｔｅｒｙ邋Ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ，邋ＭＣＡ０）逡逑

顯露右側(cè)頸總動脈（Ｃｏｍｍｏｎ邋ｃａｒｏｔｉｄ邋ａｒｔｅｒｙ，ＣＣＡ），ｌ邋ｃａｒｏｔｉｄ邋ａｒｔｅｒｙ，ＥＣＡ）和頸內(nèi)動脈（Ｉｎｔｅｒｎａｌ邋ｃａｒｏｔｉｄ邋ａｒｔｅｒｙ，，邋Ｉ脈，在頸總動脈結(jié)扎處與頸動脈分叉之間予顯微剪取一切口，菌生理鹽水沖洗后置于肝素中的線栓線（附１）沿頸總動脈視下可見栓塞線進(jìn)入頸內(nèi)動脈并向顱底方向進(jìn)線，當(dāng)栓線分叉處時，緩慢進(jìn)線，且稍感到阻力時停止進(jìn)線，此時栓線包繞頸內(nèi)動脈分叉處絲線結(jié)扎并固定栓塞線，防止栓塞線脫術(shù)野，無活動性出血，恢復(fù)右側(cè)頸部解剖結(jié)構(gòu)，縫合切口，腹腔注射鹽水補液。從栓塞成功時計時，６０ｍｉｎ后抽出栓塞待小鼠完全蘇醒后放回籠中單獨飼養(yǎng)，每天腹腔注射生理鹽線的制作逡逑
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R743.3

【參考文獻(xiàn)】

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1 陳志強;;缺血性腦血管病的研究進(jìn)展[J];亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥;2010年07期

本文編號：2644952