【摘要】：研究背景腦膠質(zhì)瘤(glioma)是顱內(nèi)最常見、致死性的原發(fā)惡性腫瘤。即便行手術(shù)及術(shù)后正規(guī)的放化療,膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma multiforme,GBM)患者的中位生存期僅14個月,5年死亡率高達(dá)95%。膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展是一個需要細(xì)胞粘附,遷移、增殖和血管生成等多重漸進(jìn)的過程。研究調(diào)控膠質(zhì)瘤進(jìn)程的分子機(jī)制及重要靶點,有助于開發(fā)新的有效治療策略。目前的研究發(fā)現(xiàn)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(Signal transducers and activators of transcription,STATs)家族在腦膠質(zhì)瘤中發(fā)揮著重要作用。STATs蛋白的酪氨酸位點磷酸化是激活STAT信號通路級聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)FRK(Fyn-related kinase)基因,即蛋白酪氨酸激酶5(protein tyrosine kinase 5,PTK5),在腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展中扮演著抑癌因子的角色。本課題旨在研究FRK在STATs激活途徑中的作用及對腦膠質(zhì)瘤生長作用的影響。研究方法1.通過慢病毒技術(shù)構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)FRK的U251與U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞系;通過蛋白免疫印跡法(Western blot,WB)檢測過表達(dá)FRK對膠質(zhì)瘤細(xì)胞中STAT信號通路相關(guān)蛋白的影響;應(yīng)用小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)技術(shù)設(shè)計FRK-siRNAs,通過脂質(zhì)體法瞬時轉(zhuǎn)染U251與U87細(xì)胞,下調(diào)FRK的表達(dá)水平,通過WB法檢測FRK下調(diào)對膠質(zhì)瘤細(xì)胞中STAT信號通路相關(guān)蛋白的影響。2.應(yīng)用JAK2的特異性抑制劑AG490處理穩(wěn)定表達(dá)FRK的U251與U87細(xì)胞,通過WB法檢測磷酸化的JAK2(p-JAK2)、磷酸化的STAT1(p-STAT1)等蛋白的變化情況。3.應(yīng)用STAT1的特異性抑制劑氟達(dá)拉濱(Fludarabine,Flu)處理穩(wěn)定表達(dá)FRK的U251或U87細(xì)胞,通過免疫共沉淀法(CO-IP)檢測FRK與STAT1的內(nèi)外源結(jié)合情況。4.應(yīng)用Flu處理穩(wěn)定表達(dá)FRK的U251細(xì)胞,通過細(xì)胞免疫熒光法觀察FRK對p-STAT1亞細(xì)胞定位的影響,通過WB法檢測FRK過表達(dá)對STAT1下游靶基因表達(dá)的影響。5.應(yīng)用脂質(zhì)體法瞬時轉(zhuǎn)染STAT1質(zhì)粒,通過CCK8或Edu細(xì)胞增殖方法檢測過表達(dá)STAT1對U251或U87細(xì)胞增殖的影響;應(yīng)用脂質(zhì)體法瞬時轉(zhuǎn)染siRNA-STAT1,通過CCK8或Edu細(xì)胞增殖方法檢測STAT1下調(diào)對U251或U87細(xì)胞增殖的影響。6.在穩(wěn)定表達(dá)FRK的U251或U87細(xì)胞中,應(yīng)用脂質(zhì)體法瞬時轉(zhuǎn)染siRNA-STAT1,通過CCK8或Edu細(xì)胞增殖方法檢測STAT1是否參與FRK對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長抑制作用。7.應(yīng)用WB法或免疫組織化學(xué)法(Immunohistochemistry,IHC),檢測FRK與STAT1在非腫瘤腦組織與各級別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況及相關(guān)性。8.將過表達(dá)FRK的U87細(xì)胞,通過立體定向注射技術(shù),植入裸鼠右側(cè)紋狀體,構(gòu)建裸鼠的腦膠質(zhì)瘤原位移植模型。通過分析裸鼠生存時間與計算腫瘤體積等,評估FRK對在體膠質(zhì)瘤生長的影響;通過Ki67組織免疫熒法,檢測FRK對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響;通過Cleaved caspase3組織免疫熒光法,檢測FRK對膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的影響;研究結(jié)果1.我們成功構(gòu)建了穩(wěn)定過表達(dá)FRK的U251及U87細(xì)胞。FRK過表達(dá)明顯上調(diào)了p-JAK2與p-STAT1的蛋白表達(dá)水平,然而對STAT3的磷酸化水平無明顯影響。FRK的下調(diào)抑制了p-JAK2與p-STAT1的蛋白表達(dá)水平,但是依然對STAT3的活化沒有影響。2.用AG490去處理FRK過表達(dá)的U251細(xì)胞,結(jié)果顯示JAK2的磷酸化水平明顯被抑制,但FRK誘導(dǎo)的STAT1的磷酸化水平上調(diào)并沒有明顯改變。3.免疫共沉淀結(jié)果顯示,FRK與STAT1內(nèi)外源均可以結(jié)合形成蛋白復(fù)合體。用Flu處理過表達(dá)的U251細(xì)胞,FRK與STAT1的結(jié)合量明顯減少。4.細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示,FRK過表達(dá)的U251細(xì)胞顯示出明顯的p-STAT1總量及核聚集增多現(xiàn)象,而Flu處理過表達(dá)FRK的U251細(xì)胞后,p-STAT1的入核量明顯減少。WB結(jié)果顯示,FRK過表達(dá)促進(jìn)了Bax的蛋白表達(dá),抑制了Bcl-2的表達(dá)。應(yīng)用Flu處理過表達(dá)FRK的U251細(xì)胞后,取消了Bax的增多現(xiàn)象,同時Bcl-2抑制效應(yīng)也被逆轉(zhuǎn)。5.CCK8與EdU細(xì)胞增殖實驗結(jié)果顯示,STAT1過表達(dá)可以明顯抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。相反,下調(diào)STAT1可以促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。6.CCK8與EdU細(xì)胞增殖實驗結(jié)果顯示,在FRK過表達(dá)情況下,STAT1的下調(diào)部分促進(jìn)了膠質(zhì)瘤U251和U87細(xì)胞的增殖。7.WB與IHC實驗結(jié)果顯示,人腦膠質(zhì)瘤組織中FRK與p-STAT1均明顯低于非腫瘤腦組織,并且隨著膠質(zhì)瘤惡性級別升高而呈降低趨勢,FRK與p-STAT1蛋白之間的表達(dá)成正相關(guān)性。8.裸鼠腦膠質(zhì)瘤原位移植模型構(gòu)建成功,生存曲線結(jié)果顯示,FRK過表達(dá)組的裸鼠生存時間明顯延長,HE染色結(jié)果顯示腫瘤的體積也明顯縮小。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示,FRK過表達(dá)組Ki67陽性率明顯降低,Cleaved caspase3陽性率明顯增高。研究結(jié)論1.FRK可以促進(jìn)JAK2與STAT1的活化,但不能激活STAT3。FRK誘導(dǎo)的STAT1的活化可能不依賴于JAK2。2.FRK可以與STAT1結(jié)合形成蛋白復(fù)合體,促進(jìn)STAT1的核移位,參與調(diào)控Bcl-2與Bax等STAT1靶基因的表達(dá)。3.STAT1可以抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖,并且參與介導(dǎo)FRK對腦膠質(zhì)瘤的生長抑制作用。4.FRK與p-STAT1均在腦膠質(zhì)瘤組織中低表達(dá),呈正相關(guān)關(guān)系。5.裸鼠在體實驗,FRK可以抑制腦膠質(zhì)瘤的生長,延長裸鼠的生存時間。
【圖文】：

二、結(jié) 果1． 研究 FRK 對 STAT 信號通路的影響膠質(zhì)瘤中 FRK 激酶與 STAT 信號通路的相關(guān)性還沒未見報道。我們試著去研究 FRK 是否參與了 STAT 信號通路。我們選擇 U251 與 U87 膠質(zhì)瘤細(xì)胞系進(jìn)行體外細(xì)胞實驗。帶有 EGFP 標(biāo)簽的 FRK 質(zhì)粒通過慢病毒包裝侵染細(xì)胞，形成穩(wěn)定表達(dá) FRK 的 U251 或 U87 細(xì)胞系。通過 WB 方法檢測到腦膠質(zhì)瘤 U251、U87 細(xì)胞中 FRK 的蛋白表達(dá)明顯升高(圖 1A-B, ***P < 0.001)。然后我們檢測了 FRK 過表達(dá)的 U251、U87 細(xì)胞中 JAK2、p-JAK2、STAT1、p-STAT1、STAT3與 p-STAT3 等蛋白的變化情況。如圖 1C-E 結(jié)果顯示 FRK 過表達(dá)明顯上調(diào)了p-JAK2 與 p-STAT1 的蛋白水平(**P < 0.01, ***P < 0.001)，然而對 STAT3 的磷酸化水平無明顯影響(N.S.，P＞0.05)。

南京醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文STAT1、 p-STAT1、STAT3、p-STAT3 與 FRK 等蛋白的變化情況。(I-J) 應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)方法分析 H 圖中 U251、U87 細(xì)胞的結(jié)果。**P < 0.01, ***P < 0.001。N.S.代表無明顯統(tǒng)計學(xué)意義。進(jìn)一步我們用RNA小干擾方法下調(diào)內(nèi)源性FRK的水平，然后我們觀察FRK敲除對 JAK/STAT 信號通路的影響。我們發(fā)現(xiàn) FRK 蛋白在 U251、U87 細(xì)胞中被有效敲除大約 70-80% (圖 1F-G, ***P < 0.001)。如圖 1H-J 所示，F(xiàn)RK 的下調(diào)抑制了 p-JAK2 與 p-STAT1 的蛋白水平(***P < 0.001)，，但是依然對 STAT3 的活化沒有影響(P＞0.05)。這些結(jié)果表明在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中 FRK 可能激活了JAK2/STAT1 信號通路，促進(jìn)了 JAK2 與 STAT1 的活化。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R739.41

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王占祥,章翔,費舟,王小仲;RNasin對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長的抑制作用[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2000年08期

2 秦憶 ,吳登蜀 ,謝俊明 ,秦天森 ,彭澤峰;惡性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞體外藥敏及P-糖蛋白檢測的臨床意義[J];中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志;2002年23期

3 董超;任君琳;張雷鳴;楊雙武;方丹東;楊韜;孟艷玲;楊安鋼;張劍寧;;針對CD44的siRNA對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87增殖與侵襲的抑制作用[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2011年11期

4 方勝,袁先厚,裴永恩,王國安;腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞P-糖蛋白表達(dá)及臨床意義[J];臨床外科雜志;2001年01期

5 宋宇;魏志玄;;HtrA2在大鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)[J];中國實用神經(jīng)疾病雜志;2013年06期

6 謝萬福;王佳;郭凱;徐高峰;李傳坤;王茂德;;C-erbB2在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)的研究[J];現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué);2013年09期

7 董超;任君琳;張雷鳴;楊雙武;方丹東;陳曉燕;孟艷玲;楊安鋼;張劍寧;;針對CD44的siRNA對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞A172增殖與凋亡的影響[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2012年03期

8 李春暉;李志紅;史彥芳;郭毅;丁亞楠;劉海鵬;崔凱;;EphB4為靶的siRNA抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的體外實驗研究[J];中國神經(jīng)精神疾病雜志;2010年03期

9 尚學(xué)義;王小木;陳剛;劉娜;張健;王立峰;劉新平;鄧艷春;;穩(wěn)定轉(zhuǎn)染基因ndrg2腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的建立[J];中華神經(jīng)外科疾病研究雜志;2008年04期

10 羅俊生;張齊;關(guān)寧;霍小川;;人參皂苷對惡性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞BT325增殖的影響[J];遼寧中醫(yī)雜志;2006年10期

相關(guān)會議論文 前10條

1 白霞;傅建新;丁凱陽;岑建農(nóng);王兆鉞;阮長耿;;組織因子途徑抑制物-2基因逆病毒載體的構(gòu)建、表達(dá)及其對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和浸潤能力的影響[A];2005年華東六省一市血液病學(xué)學(xué)術(shù)會議暨浙江省血液病學(xué)學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2005年

2 趙明;李安民;常津;王漢杰;;利用生物多聚體納米粒子包載提高腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)藥物濃度[A];中國醫(yī)師協(xié)會神經(jīng)外科醫(yī)師分會第六屆全國代表大會論文匯編[C];2011年

3 趙明;李安民;常津;王漢杰;;利用生物多聚體納米粒子包載提高腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)藥物濃度[A];中華醫(yī)學(xué)會神經(jīng)外科學(xué)分會第九次學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2010年

4 趙明;李安民;常津;;利用生物多聚體納米粒子包載提高腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)藥物濃度[A];2011中華醫(yī)學(xué)會神經(jīng)外科學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2011年

5 王成偉;王志剛;曲春城;冀勇;李衛(wèi)國;郝曉光;展如才;;腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)分化及惡性表型逆轉(zhuǎn)的研究[A];中華醫(yī)學(xué)會神經(jīng)外科學(xué)分會第九次學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2010年

6 黃偉;吳小軍;孫克華;胡國漢;駱純;陳菊祥;黃承光;盧亦成;;EZH2基因調(diào)控腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的實驗研究[A];中華醫(yī)學(xué)會神經(jīng)外科學(xué)分會第九次學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2010年

7 王占祥;王海東;陳玉英;劉希堯;譚國偉;沈上杭;;Pygo2在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞和組織的表達(dá)及臨床意義[A];中國醫(yī)師協(xié)會神經(jīng)外科醫(yī)師分會第六屆全國代表大會論文匯編[C];2011年

8 馮麗波;童流妹;陸雪官;陳列松;田野;;乏氧通過改變CD133+細(xì)胞的表達(dá)引起腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞放射耐受的初步研究[A];中華醫(yī)學(xué)會放射腫瘤治療學(xué)分會六屆二次暨中國抗癌協(xié)會腫瘤放療專業(yè)委員會二屆二次學(xué)術(shù)會議論文集[C];2009年

9 林衛(wèi)紅;謝曉娜;崔俐;王紹;;抑膠素對C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)影響的研究[A];第十一屆全國神經(jīng)病學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2008年

10 陳慧;李向陽;謝奇朋;楊軍軍;王增壽;;紫杉醇影響C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長和凋亡的研究[A];2009年浙江省檢驗醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2009年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 華磊;FRK激活STAT1對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長作用的研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2019年

2 黃河;貝伐單抗通過激活自噬對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞化療耐藥的影響[D];南方醫(yī)科大學(xué);2018年

3 高麗;腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞DNA聚合酶β、Fas、p53基因突變及其在mRNA水平表達(dá)的研究[D];鄭州大學(xué);2005年

4 李U

本文編號：2643831