【摘要】：研究背景腦膠質(zhì)瘤(glioma)是顱內(nèi)最常見、致死性的原發(fā)惡性腫瘤。即便行手術(shù)及術(shù)后正規(guī)的放化療,膠質(zhì)母細胞瘤(glioblastoma multiforme,GBM)患者的中位生存期僅14個月,5年死亡率高達95%。膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展是一個需要細胞粘附,遷移、增殖和血管生成等多重漸進的過程。研究調(diào)控膠質(zhì)瘤進程的分子機制及重要靶點,有助于開發(fā)新的有效治療策略。目前的研究發(fā)現(xiàn)信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子(Signal transducers and activators of transcription,STATs)家族在腦膠質(zhì)瘤中發(fā)揮著重要作用。STATs蛋白的酪氨酸位點磷酸化是激活STAT信號通路級聯(lián)反應的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)FRK(Fyn-related kinase)基因,即蛋白酪氨酸激酶5(protein tyrosine kinase 5,PTK5),在腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展中扮演著抑癌因子的角色。本課題旨在研究FRK在STATs激活途徑中的作用及對腦膠質(zhì)瘤生長作用的影響。研究方法1.通過慢病毒技術(shù)構(gòu)建穩(wěn)定表達FRK的U251與U87膠質(zhì)瘤細胞系;通過蛋白免疫印跡法(Western blot,WB)檢測過表達FRK對膠質(zhì)瘤細胞中STAT信號通路相關(guān)蛋白的影響;應用小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)技術(shù)設(shè)計FRK-siRNAs,通過脂質(zhì)體法瞬時轉(zhuǎn)染U251與U87細胞,下調(diào)FRK的表達水平,通過WB法檢測FRK下調(diào)對膠質(zhì)瘤細胞中STAT信號通路相關(guān)蛋白的影響。2.應用JAK2的特異性抑制劑AG490處理穩(wěn)定表達FRK的U251與U87細胞,通過WB法檢測磷酸化的JAK2(p-JAK2)、磷酸化的STAT1(p-STAT1)等蛋白的變化情況。3.應用STAT1的特異性抑制劑氟達拉濱(Fludarabine,Flu)處理穩(wěn)定表達FRK的U251或U87細胞,通過免疫共沉淀法(CO-IP)檢測FRK與STAT1的內(nèi)外源結(jié)合情況。4.應用Flu處理穩(wěn)定表達FRK的U251細胞,通過細胞免疫熒光法觀察FRK對p-STAT1亞細胞定位的影響,通過WB法檢測FRK過表達對STAT1下游靶基因表達的影響。5.應用脂質(zhì)體法瞬時轉(zhuǎn)染STAT1質(zhì)粒,通過CCK8或Edu細胞增殖方法檢測過表達STAT1對U251或U87細胞增殖的影響;應用脂質(zhì)體法瞬時轉(zhuǎn)染siRNA-STAT1,通過CCK8或Edu細胞增殖方法檢測STAT1下調(diào)對U251或U87細胞增殖的影響。6.在穩(wěn)定表達FRK的U251或U87細胞中,應用脂質(zhì)體法瞬時轉(zhuǎn)染siRNA-STAT1,通過CCK8或Edu細胞增殖方法檢測STAT1是否參與FRK對膠質(zhì)瘤細胞的生長抑制作用。7.應用WB法或免疫組織化學法(Immunohistochemistry,IHC),檢測FRK與STAT1在非腫瘤腦組織與各級別膠質(zhì)瘤中的表達情況及相關(guān)性。8.將過表達FRK的U87細胞,通過立體定向注射技術(shù),植入裸鼠右側(cè)紋狀體,構(gòu)建裸鼠的腦膠質(zhì)瘤原位移植模型。通過分析裸鼠生存時間與計算腫瘤體積等,評估FRK對在體膠質(zhì)瘤生長的影響;通過Ki67組織免疫熒法,檢測FRK對膠質(zhì)瘤細胞增殖的影響;通過Cleaved caspase3組織免疫熒光法,檢測FRK對膠質(zhì)瘤細胞凋亡的影響;研究結(jié)果1.我們成功構(gòu)建了穩(wěn)定過表達FRK的U251及U87細胞。FRK過表達明顯上調(diào)了p-JAK2與p-STAT1的蛋白表達水平,然而對STAT3的磷酸化水平無明顯影響。FRK的下調(diào)抑制了p-JAK2與p-STAT1的蛋白表達水平,但是依然對STAT3的活化沒有影響。2.用AG490去處理FRK過表達的U251細胞,結(jié)果顯示JAK2的磷酸化水平明顯被抑制,但FRK誘導的STAT1的磷酸化水平上調(diào)并沒有明顯改變。3.免疫共沉淀結(jié)果顯示,FRK與STAT1內(nèi)外源均可以結(jié)合形成蛋白復合體。用Flu處理過表達的U251細胞,FRK與STAT1的結(jié)合量明顯減少。4.細胞免疫熒光結(jié)果顯示,FRK過表達的U251細胞顯示出明顯的p-STAT1總量及核聚集增多現(xiàn)象,而Flu處理過表達FRK的U251細胞后,p-STAT1的入核量明顯減少。WB結(jié)果顯示,FRK過表達促進了Bax的蛋白表達,抑制了Bcl-2的表達。應用Flu處理過表達FRK的U251細胞后,取消了Bax的增多現(xiàn)象,同時Bcl-2抑制效應也被逆轉(zhuǎn)。5.CCK8與EdU細胞增殖實驗結(jié)果顯示,STAT1過表達可以明顯抑制腦膠質(zhì)瘤細胞的增殖。相反,下調(diào)STAT1可以促進腦膠質(zhì)瘤細胞的增殖。6.CCK8與EdU細胞增殖實驗結(jié)果顯示,在FRK過表達情況下,STAT1的下調(diào)部分促進了膠質(zhì)瘤U251和U87細胞的增殖。7.WB與IHC實驗結(jié)果顯示,人腦膠質(zhì)瘤組織中FRK與p-STAT1均明顯低于非腫瘤腦組織,并且隨著膠質(zhì)瘤惡性級別升高而呈降低趨勢,FRK與p-STAT1蛋白之間的表達成正相關(guān)性。8.裸鼠腦膠質(zhì)瘤原位移植模型構(gòu)建成功,生存曲線結(jié)果顯示,FRK過表達組的裸鼠生存時間明顯延長,HE染色結(jié)果顯示腫瘤的體積也明顯縮小。細胞免疫熒光結(jié)果顯示,FRK過表達組Ki67陽性率明顯降低,Cleaved caspase3陽性率明顯增高。研究結(jié)論1.FRK可以促進JAK2與STAT1的活化,但不能激活STAT3。FRK誘導的STAT1的活化可能不依賴于JAK2。2.FRK可以與STAT1結(jié)合形成蛋白復合體,促進STAT1的核移位,參與調(diào)控Bcl-2與Bax等STAT1靶基因的表達。3.STAT1可以抑制腦膠質(zhì)瘤細胞的增殖,并且參與介導FRK對腦膠質(zhì)瘤的生長抑制作用。4.FRK與p-STAT1均在腦膠質(zhì)瘤組織中低表達,呈正相關(guān)關(guān)系。5.裸鼠在體實驗,FRK可以抑制腦膠質(zhì)瘤的生長,延長裸鼠的生存時間。
【圖文】：

二、結(jié) 果1． 研究 FRK 對 STAT 信號通路的影響膠質(zhì)瘤中 FRK 激酶與 STAT 信號通路的相關(guān)性還沒未見報道。我們試著去研究 FRK 是否參與了 STAT 信號通路。我們選擇 U251 與 U87 膠質(zhì)瘤細胞系進行體外細胞實驗。帶有 EGFP 標簽的 FRK 質(zhì)粒通過慢病毒包裝侵染細胞，形成穩(wěn)定表達 FRK 的 U251 或 U87 細胞系。通過 WB 方法檢測到腦膠質(zhì)瘤 U251、U87 細胞中 FRK 的蛋白表達明顯升高(圖 1A-B, ***P < 0.001)。然后我們檢測了 FRK 過表達的 U251、U87 細胞中 JAK2、p-JAK2、STAT1、p-STAT1、STAT3與 p-STAT3 等蛋白的變化情況。如圖 1C-E 結(jié)果顯示 FRK 過表達明顯上調(diào)了p-JAK2 與 p-STAT1 的蛋白水平(**P < 0.01, ***P < 0.001)，然而對 STAT3 的磷酸化水平無明顯影響(N.S.，P＞0.05)。

南京醫(yī)科大學博士學位論文STAT1、 p-STAT1、STAT3、p-STAT3 與 FRK 等蛋白的變化情況。(I-J) 應用統(tǒng)計學方法分析 H 圖中 U251、U87 細胞的結(jié)果。**P < 0.01, ***P < 0.001。N.S.代表無明顯統(tǒng)計學意義。進一步我們用RNA小干擾方法下調(diào)內(nèi)源性FRK的水平，然后我們觀察FRK敲除對 JAK/STAT 信號通路的影響。我們發(fā)現(xiàn) FRK 蛋白在 U251、U87 細胞中被有效敲除大約 70-80% (圖 1F-G, ***P < 0.001)。如圖 1H-J 所示，F(xiàn)RK 的下調(diào)抑制了 p-JAK2 與 p-STAT1 的蛋白水平(***P < 0.001)，，但是依然對 STAT3 的活化沒有影響(P＞0.05)。這些結(jié)果表明在膠質(zhì)瘤細胞中 FRK 可能激活了JAK2/STAT1 信號通路，促進了 JAK2 與 STAT1 的活化。
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R739.41

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本文編號：2643831