發(fā)布時(shí)間：2020-04-25 22:58

【摘要】：癲癇是一種常見的慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病,具有發(fā)作性、反復(fù)性、刻板性等特征,具有較高的發(fā)病率和致死率。顳葉癲癇(temporal lobe epilepsy,TLE)是各種癲癇綜合征最常見的類型,以反復(fù)的自發(fā)性發(fā)作為特點(diǎn),反復(fù)的癲癇發(fā)作會(huì)嚴(yán)重影響患者的工作、生活和學(xué)習(xí),還常常造成癲癇患者并發(fā)認(rèn)知功能的障礙,出現(xiàn)記憶力的下降,進(jìn)一步加重患者的心理創(chuàng)傷。目前,三分之二的癲癇病人可以通過服用抗癲癇藥物控制或減少癲癇發(fā)作,而剩余三分之一的患者抗癲癇藥物治療效果不佳,成為藥物難治性癲癇。現(xiàn)階段臨床使用的大部分抗癲癇藥物也僅能控制癲癇急性發(fā)作的癥狀,很少能延緩癲癇的形成進(jìn)程,更不可能治愈癲癇。因此,尋找能夠有效阻止癲癇形成并改善患者認(rèn)知障礙的藥物對(duì)于改善患者的生活質(zhì)量有重要意義。癲癇發(fā)作可導(dǎo)致不同程度的腦損傷,表現(xiàn)為神經(jīng)元的變性、壞死。加強(qiáng)癲癇繼發(fā)神經(jīng)元損傷機(jī)理及保護(hù)措施的研究已成為癲癇防治的重要環(huán)節(jié),引發(fā)了廣泛關(guān)注。癲癇的發(fā)病機(jī)制涉及興奮性氨基酸毒性學(xué)說、氧化應(yīng)激損傷、鈣超載、能量失衡、炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)、凋亡相關(guān)蛋白的激活等,這些機(jī)制相互交錯(cuò),相互影響,促進(jìn)了癲癇的形成和發(fā)展。尤其是氧化應(yīng)激損傷、炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)、程序性凋亡均存在于癲癇病灶、病灶周邊及遠(yuǎn)隔受損的組織中,是導(dǎo)致神經(jīng)元功能障礙乃至死亡的主要原因。因此,抗氧化應(yīng)激、抑制炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)及凋亡已成為保護(hù)癲癇繼發(fā)腦神經(jīng)元損傷的重要方面。亞甲藍(lán)(methylene blue,MB)是一種可溶于水的吩噻秦類化合物,具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗凋亡等多種生物活性。它憑借強(qiáng)大的親脂性可快速通過血腦屏障,很容易在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)蓄積從而發(fā)揮直接的神經(jīng)保護(hù)作用。研究證實(shí),MB不僅對(duì)側(cè)索性硬化、Leber視神經(jīng)病變、缺血性腦卒、帕金森病都有神經(jīng)保護(hù)作用,還可改善阿爾茲海默癥患者的記憶能力,成為治療輕度認(rèn)知功能障礙的潛在藥物。近些年來MB在臨床中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的應(yīng)用越來越普遍,但對(duì)癲癇的神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制尚未見明確報(bào)導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)采用電刺激杏仁基底外側(cè)核(basolateral amygdala,BLA)建立自發(fā)性癲癇持續(xù)狀態(tài)(self-sustaining status epilepticus,SSSE)和慢性點(diǎn)燃兩種模型,觀察MB在急性癲癇發(fā)作、癲癇形成及癲癇繼發(fā)認(rèn)知障礙中的神經(jīng)保護(hù)作用,并對(duì)其中可能的機(jī)制進(jìn)行了探討,以期對(duì)新型抗癲癇藥物或癲癇繼發(fā)神經(jīng)損傷保護(hù)劑起到補(bǔ)充的效果。第一部分杏仁基底外側(cè)核電點(diǎn)燃大鼠癲癇模型的建立目的:采用不同的刺激參數(shù)對(duì)BLA進(jìn)行電刺激,誘發(fā)SSSE模型和BLA慢性點(diǎn)燃模型,觀察記錄大鼠的后放電、癇性發(fā)作分級(jí)及腦電(electroencephalogram,EEG)等情況,總結(jié)模型制作過程中的經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn),提高該模型在本實(shí)驗(yàn)室成功率,為新型抗癲癇藥物或神經(jīng)保護(hù)劑研發(fā)奠定模型基礎(chǔ)。方法:將健康成年雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為4組,每組15只。對(duì)照組(Control):不接受任何實(shí)驗(yàn)處理;假手術(shù)組(Sham):BLA植入電極,但不予以刺激;慢性點(diǎn)燃組(EP):BLA植入電極,予以慢性點(diǎn)燃誘導(dǎo)電刺激;急性癲癇發(fā)作組(SSSE):BLA植入電極,予以SSSE誘導(dǎo)電刺激。在立體定位儀的協(xié)助下,將Teflon絕緣材料制作的刺激電極植入至右側(cè)BLA(前囟后2.2mm,旁開4.7mm,深8.5mm)。電刺激誘導(dǎo)前24h測(cè)定后放電閾值(afterdischarge threshold,ADT),符合規(guī)定的大鼠采用不同的刺激參數(shù)誘導(dǎo)慢性電點(diǎn)燃和SSSE模型。實(shí)驗(yàn)1,慢性電點(diǎn)燃模型的建立:符合ADT標(biāo)準(zhǔn)的Wistar大鼠給予每天1次的電刺激,刺激參數(shù)為500μA恒流電流,頻率60Hz,波寬1.0ms,單向方波,持續(xù)1s。癲癇發(fā)作行為學(xué)等級(jí)根據(jù)Racine分級(jí)法評(píng)定,連續(xù)3d出現(xiàn)5級(jí)發(fā)作即認(rèn)為大鼠點(diǎn)燃成功。每天觀察記錄每只大鼠點(diǎn)燃過程中發(fā)生的事件,包括電極脫落、死亡、發(fā)作等級(jí)、后放電持續(xù)時(shí)間等。實(shí)驗(yàn)2,SSSE模型的建立:符合ADT標(biāo)準(zhǔn)的Wistar大鼠給予總共25min的電刺激,刺激參數(shù)為700μA恒流電流,波寬為1ms,頻率為50Hz的雙向方波連續(xù)刺激100ms,以每秒2次的頻率發(fā)放。結(jié)束后立即連接EEG記錄系統(tǒng)。SSSE誘導(dǎo)成功的標(biāo)準(zhǔn)為:電刺激停止后出現(xiàn)的高幅(2倍基線)、高頻(8Hz)、持續(xù)時(shí)間至少5s的后放電,此類型后放電持續(xù)或間斷(1-3s)出現(xiàn)至少15min。SSSE誘導(dǎo)成功后觀察記錄每只大鼠腦電記錄過程中發(fā)生的事件,包括電極脫落、死亡、后放電發(fā)放次數(shù)、持續(xù)時(shí)間和誘導(dǎo)SSSE成功率等,共計(jì)12h。結(jié)果:1.Control組和Sham組大鼠全程無癲癇發(fā)作。2.EP組慢性電點(diǎn)燃模型:對(duì)15只大鼠ADT測(cè)定,1只大鼠未引出明顯后放電,另有2只大鼠ADT超過300μA,最終有12只大鼠ADT達(dá)標(biāo),進(jìn)入后序慢性點(diǎn)燃誘導(dǎo)程序。在慢性點(diǎn)燃期間,1只大鼠發(fā)生電極脫落,1只點(diǎn)燃過程中死亡,1只大鼠在點(diǎn)燃過程中發(fā)生顱骨感染,造成后放電消失。此3只無法完成后續(xù)點(diǎn)燃,排除出實(shí)驗(yàn)。最終有9只大鼠經(jīng)過22d被成功點(diǎn)燃,連續(xù)3d均發(fā)生5級(jí)發(fā)作,癇性發(fā)作敏感性長期維持。3.SSSE模型:對(duì)15只大鼠ADT測(cè)定,1只大鼠未引出明顯后放電,另有1只大鼠ADT超300μA,最終有13只大鼠ADT達(dá)標(biāo),進(jìn)入后序SSSE誘導(dǎo)程序。經(jīng)過25min SSSE電刺激誘導(dǎo),最終有9只大鼠成功誘導(dǎo)出SSSE,成功率為69.23%。1只未能成功誘導(dǎo)出SSSE,2只發(fā)生電極脫落,1只大鼠在此過程中死亡,死亡率為7.69%。EEG記錄12h后,后放電發(fā)放次數(shù)為36.22±2.67次,后放電持續(xù)時(shí)間為53.44±6.26min。第二部分亞甲藍(lán)對(duì)杏仁基底外側(cè)核電刺激誘導(dǎo)SSSE大鼠的腦保護(hù)作用及機(jī)制研究目的:建立BLA誘導(dǎo)SSSE急性癲癇發(fā)作大鼠模型,觀察MB對(duì)SSSE大鼠急性癲癇發(fā)作次數(shù)及累計(jì)時(shí)間的影響和對(duì)海馬神經(jīng)元損傷保護(hù)作用,并探討可能的機(jī)制。方法:以健康成年雄性Wistar大鼠(180-230g)50只為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,隨機(jī)分為4組。對(duì)照組(Control):不接受任何實(shí)驗(yàn)處理;假手術(shù)組(Sham):BLA植入電極,但不予以刺激;SSSE組:BLA植入電極,予以SSSE誘導(dǎo)電刺激;SSSE+MB組:SSSE建立后5min給予腹腔注射1 mg/Kg的MB。Control和Sham組各有12只大鼠,SSSE和SSSE+MB組各有13只大鼠。SSSE誘導(dǎo)過程同第一部分。誘導(dǎo)結(jié)束后連續(xù)記錄EEG總計(jì)12h。通過EEG典型SSSE后放電次數(shù)及累計(jì)發(fā)作時(shí)間比較各組SSSE的嚴(yán)重程度。24h后對(duì)大鼠海馬進(jìn)行取材,酶聯(lián)免疫法檢測(cè)MDA/GSH含量,尼氏染色觀察海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)神經(jīng)元的損傷情況,Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Caspase3、BCL2及BAX的表達(dá)。結(jié)果:1.SSSE組1只大鼠在誘發(fā)程中死亡,SSSE+MB組1只大鼠誘發(fā)SSSE失敗,均排除出實(shí)驗(yàn)。至此,每組共有12只大鼠納入后序?qū)嶒?yàn)。SSSE組和SSSE+MB組之間癇性放電次數(shù)差別具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),累計(jì)發(fā)作時(shí)間差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。Control組和Sham組大鼠未有癲癇發(fā)作。2.和Control組相比,SSSE組MDA的含量明顯升高(P0.01),GSH含量明顯下降(P0.01)。和SSSE組相比,SSSE+MB組MDA水平顯著降低(P0.01),而GSH水平顯著升高(P0.01)。MDA和GSH含量在Sham組和Control組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。3.和Control組相比,SSSE組海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)錐體神經(jīng)元固縮,形態(tài)欠規(guī)則,且明顯稀疏,存活神經(jīng)元的數(shù)量顯著減少(P0.01)。和SSSE組相比,SSSE+MB組神經(jīng)元形態(tài)明顯改善,神經(jīng)元的丟失明顯減少(P0.01)。Sham組神經(jīng)元數(shù)量和Control組相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。4.和Control組相比,SSSE組海馬Caspase3表達(dá)升高(P0.05)。和SSSE組相比,SSSE+MB組海馬Caspase3表達(dá)水平回落(P0.05)。與Caspase3相反,BCL2表達(dá)在SSSE組較Control組下降(P0.05),而在SSSE+MB組回升,和SSSE組比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。BAX在各組大鼠中的變化趨勢(shì)和Caspase3基本相同。第三部分亞甲藍(lán)對(duì)杏仁基底外側(cè)核慢性電點(diǎn)燃大鼠癲癇形成及認(rèn)知功能的影響目的:建立BLA誘導(dǎo)慢性點(diǎn)燃大鼠癲癇模型,研究MB對(duì)癲癇的形成過程以及癲癇導(dǎo)致的認(rèn)知障礙的影響。方法:以健康成年雄性Wistar大鼠(180-230g)40只為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,隨機(jī)分為4組,每組10只。對(duì)照組(Control):不接受任何實(shí)驗(yàn)處理;假手術(shù)組(Sham):BLA植入電極,但不予以刺激;慢性點(diǎn)燃組(EP):BLA植入電極,每天予以點(diǎn)燃一次;MB+EP組:每天點(diǎn)燃前30min腹腔注射1mg/Kg的MB。BLA慢性電點(diǎn)燃大鼠癲癇誘導(dǎo)過程同第一部分。大鼠連續(xù)3d出現(xiàn)5級(jí)發(fā)作認(rèn)為點(diǎn)燃成功。每天記錄大鼠的癇性發(fā)作等級(jí)及ADD,直至EP組大鼠全部點(diǎn)燃。結(jié)束后進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)各組大鼠的學(xué)習(xí)、記憶等認(rèn)知能力。結(jié)果:1.重復(fù)測(cè)量方差分析表明,兩組之間發(fā)作等級(jí)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(0.01P=0.0420.05),MB處理和時(shí)間無交互作用(P0.05),提示兩組的變化趨勢(shì)相同;兩組之間ADD存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(0.01P=0.020.05),且MB處理和時(shí)間存在交互作用(P0.05),提示兩組的變化趨勢(shì)不同。最終,經(jīng)過20d的刺激,EP組9只大鼠全部被成功點(diǎn)燃,癇性發(fā)作敏感性長期維持;而MB+EP組第20d發(fā)作等級(jí)平均為4.44級(jí)。2.定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,四組大鼠的逃避潛伏期在實(shí)驗(yàn)的前兩天都沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。實(shí)驗(yàn)的3-5d,各組大鼠的逃避潛伏期均呈現(xiàn)比前兩天縮短的趨勢(shì)。與Control組大鼠逃避潛伏期相比,EP組大鼠的逃避潛伏期均延長(P0.05);MB+EP組大鼠的逃避潛伏期較EP組大鼠均縮短(P0.05),但與Control組相比仍延長(P0.05)。Sham組大鼠的逃避潛伏期和Control組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。3.空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,EP組大鼠120s內(nèi)穿越平臺(tái)的次數(shù)明顯少于Control組(P0.01);MB+EP組大鼠120s內(nèi)穿越平臺(tái)的次數(shù)較EP組次數(shù)增多(P0.05)。EP組大鼠在目標(biāo)象限逗留的時(shí)間比Control組明顯縮短(P0.01)。MB+EP組大鼠逗留的時(shí)間為較EP組增加(P0.05)。Sham組與Control組相比,大鼠的穿越平臺(tái)次數(shù)和在目標(biāo)象限逗留的時(shí)間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。第四部分亞甲藍(lán)影響杏仁基底外側(cè)核慢性電點(diǎn)燃大鼠癲癇形成機(jī)制研究目的:建立BLA誘導(dǎo)慢性點(diǎn)燃大鼠癲癇模型,研究癲癇形成過程中的炎性機(jī)制,探討MB在癲癇形成過程中表現(xiàn)出的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制。方法:以健康成年雄性Wistar大鼠(180-230g)36只為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,隨機(jī)分為4組,每組9只。對(duì)照組(Control):不接受任何實(shí)驗(yàn)處理;假手術(shù)組(Sham):BLA植入電極,但不予以刺激;慢性點(diǎn)燃組(EP):BLA植入電極,每天予以點(diǎn)燃一次;MB+EP組:每天點(diǎn)燃前30min腹腔注射1 mg/Kg的MB。BLA慢性電點(diǎn)燃大鼠癲癇誘導(dǎo)過程同第一部分。大鼠連續(xù)3d出現(xiàn)5級(jí)發(fā)作認(rèn)為點(diǎn)燃成功。每天記錄大鼠的癇性發(fā)作等級(jí)及ADD,直至點(diǎn)燃組大鼠全部點(diǎn)燃。結(jié)束后對(duì)大鼠海馬進(jìn)行取材,Western blot檢測(cè)炎癥相關(guān)蛋白NF-ΚB、IL-1β及IL-6的表達(dá)。結(jié)果:NF-ΚB在Control組海馬組織中正常表達(dá),Sham組與其沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。和Control組相比,EP組和MB+EP組中NF-ΚB表達(dá)明顯升高,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。而MB+EP組和EP組相比,NF-ΚB表達(dá)明顯下降(P0.05)。IL-1β及IL-6在各組的表達(dá)趨勢(shì)和NF-ΚB一致。結(jié)論:1.本實(shí)驗(yàn)通過電刺激BLA成功建立了SSSE和慢性點(diǎn)燃兩種模型。這兩種模型都具有誘導(dǎo)或點(diǎn)燃成功率高,癇性發(fā)作穩(wěn)定,可控性、重復(fù)性好等特點(diǎn)。癇性發(fā)作和癲癇形成過程與人類TLE類似,是研究人類TLE發(fā)病機(jī)制的理想模型。2.MB可有效緩解急性癲癇發(fā)作的嚴(yán)重程度,減少神經(jīng)元的丟失,發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用,其神經(jīng)保護(hù)機(jī)制可能和提升機(jī)體抗氧化應(yīng)激損傷和抗凋亡能力有關(guān)。3.NF-ΚB、IL-1β、IL-6等炎性因子的上調(diào)參與了癲癇形成的病理生理過程,而MB可在一定程度延緩癲癇的形成并改善癲癇大鼠的認(rèn)知,其神經(jīng)保護(hù)作用可能和下調(diào)NF-ΚB等炎癥因子的表達(dá),減輕炎癥反應(yīng)有關(guān)。
【圖文】：

圖 1 電極植入過程Fig.1 Process of electrode implantationNote: (A) Mounted on a stereotaxic instrument. (B) Exposed skull and drilled. (C)Ground electrode and screws using to fix the dental cement. (D) Insert the stimulatingelectrodes. (E) Fixed the electrodes with dental cement. (F) Fixed the miniaturereceptacle.

27圖 2 大鼠頭部電極端子、刺激器及腦電記錄系統(tǒng)連接示意圖Fig.2 Schematic diagram of wires connectionNote: The wires connected the miniature receptacle on the rat head with EEG recorderand stimulation isolators. Through the wires, the amygdaloid electrode was connected to aswitch. The plug was switched to the left to deliver the kindling stimulus, and switched tothe right to record EEG.
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R742.1

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