【摘要】：第一部分轉(zhuǎn)錄因子RBPJ參與神經(jīng)母細(xì)胞瘤Notch信號通路調(diào)控過程目的:探索研究神經(jīng)母細(xì)胞瘤(NB)中參與Notch信號通路過程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,并探索該轉(zhuǎn)錄因子在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的調(diào)控作用。方法:通過綜合分析GEO(GSE62564)數(shù)據(jù)庫,找到參與神經(jīng)母細(xì)胞瘤分期、進(jìn)展及MYCN擴(kuò)增的Notch信號通路相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子,綜合分析出有意義的轉(zhuǎn)錄因子,進(jìn)一步通過GEO數(shù)據(jù)庫分析該轉(zhuǎn)錄因子在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中生存意義并分析該轉(zhuǎn)錄因子在神經(jīng)母細(xì)胞瘤不同分期、進(jìn)展及MYCN擴(kuò)增的NB中的表達(dá)水平。進(jìn)一步通過蛋白免疫印跡(Western-blot),免疫組織化學(xué)方法(IHC)檢測該轉(zhuǎn)錄因子在分化良好的神經(jīng)母細(xì)胞瘤、低分化神經(jīng)母細(xì)胞瘤及未分化神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織中表達(dá)水平,并探討其是否具有臨床意義,最后通過實(shí)時(shí)定量PCR、Ch IP等實(shí)驗(yàn)方法證實(shí)該轉(zhuǎn)錄因子對Notch信號通路調(diào)節(jié)過程中相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄活性及表達(dá)水平的影響。結(jié)果:GEO數(shù)據(jù)庫綜合分析顯示轉(zhuǎn)錄因子MAML3與RBPJ是可能參與神經(jīng)母細(xì)胞瘤Notch信號通路過程的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。GEO數(shù)據(jù)庫(GSE62564)分析上述兩種轉(zhuǎn)錄因子在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的生存,我們選擇了生存意義較大的RBPJ進(jìn)行分析,GEO(GSE62564)數(shù)據(jù)庫分析、免疫組化、及Westren-blot檢測神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株和不同分化組織中的結(jié)果表示,RBPJ在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中呈現(xiàn)出高表達(dá)狀態(tài)。在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株中敲低RBPJ可以顯著增加Notch信號通路相關(guān)基因HES1,HES4,HEY1,HEY2的轉(zhuǎn)錄水平(p0.01),但對OCT4的轉(zhuǎn)錄水平無明顯影響(p0.05)。此外,敲低RBPJ能夠明顯抑制RBPJ與下游啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合(p0.01)。結(jié)論:在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中,轉(zhuǎn)錄因子RBPJ可以通過結(jié)合相關(guān)Notch信號通路相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,具體調(diào)節(jié)基因?yàn)镠ES1,HES4,HEY1和HEY2,同時(shí),RBPJ在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中作為一個(gè)預(yù)后不良因素存在。第二部分SNW1蛋白與轉(zhuǎn)錄因子RBPJ在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中相互作用目的:探討在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中與轉(zhuǎn)錄因子RBPJ相互作用的蛋白,進(jìn)一步探索RBPJ上游的調(diào)控。檢測該上游蛋白在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)情況,并驗(yàn)證其相互作用。方法:利用IID,Bio GRID和STRING數(shù)據(jù)庫,分析與RBPJ相互作用的蛋白,通過IP和考馬斯亮藍(lán)染液方法進(jìn)一步驗(yàn)證上述數(shù)據(jù)庫所推導(dǎo)蛋白;通過正向和反向Co-IP進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子RBPJ與其相互作用,利用雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)(Bi FC)驗(yàn)證二者是否直接相互作用。通過GEO(GSE62564)數(shù)據(jù)庫分析互作蛋白生存意義及探究其與神經(jīng)母細(xì)胞瘤分期、進(jìn)展、MYCN擴(kuò)增的轉(zhuǎn)錄水平,通過免疫組織化學(xué)方法(IHC)檢測該蛋白在節(jié)細(xì)胞神經(jīng)母細(xì)胞瘤、分化良好的神經(jīng)母細(xì)胞瘤、低分化神經(jīng)母細(xì)胞瘤及未分化神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織中表達(dá)水平,探討其是否具有臨床意義;結(jié)果:綜合多種蛋白互作數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子RBPJ可能與7種蛋白相互作用,接下來在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株中通過IP和考馬斯亮藍(lán)染色進(jìn)一步驗(yàn)證了RBPJ可能與SNW1相互作用;此外,通過正向和反向Co-IP驗(yàn)證了RBPJ與SNW1相互作用,雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)(Bi FC)證實(shí)了其推導(dǎo)的正確性;通過GEO(GSE62564)數(shù)據(jù)庫分析表明SNW1的生存意義(p0.01),并與神經(jīng)母細(xì)胞瘤的分期、進(jìn)展及MYCN的擴(kuò)增密切相關(guān)(p0.01),臨床標(biāo)本SNW1表達(dá)水平在節(jié)細(xì)胞神經(jīng)母細(xì)胞瘤、分化良好的神經(jīng)母細(xì)胞瘤、低分化神經(jīng)母細(xì)胞瘤及未分化神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織中依次升高(p0.01),數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果表明,SNW1與RBPJ其轉(zhuǎn)錄水平呈正相關(guān)性,其中R=0.3975(p0.01)。結(jié)論:這些數(shù)據(jù)表明SNW1能夠與RBPJ相互作用,SNW1在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中作為預(yù)后不良因素且與RBPJ呈正向相關(guān)性。第三部分SNW1抑制Notch信號通路通過與RBPJ相互作用目的:探討在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中SNW1調(diào)控Notch信號通路的機(jī)制。方法:建立并篩選穩(wěn)定敲低RBPJ與過表達(dá)/敲低SNW1的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株,評估過表達(dá)/敲低SNW1對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株Notch信號通路的調(diào)控過程,RBPJ與SNW1進(jìn)行回補(bǔ)實(shí)驗(yàn),通過Western-blot進(jìn)行RBPJ與SNW1表達(dá)水平的驗(yàn)證,并進(jìn)一步通過實(shí)時(shí)定量PCR對Notch信號通路下游靶基因HES1、HES4、HEY1、HEY2和OCT4轉(zhuǎn)錄水平的檢測,通過回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)研究SNW1調(diào)控Notch信號通路的調(diào)控機(jī)制。結(jié)果:與對照組相比,過表達(dá)SNW1能夠明顯抑制Notch信號通路靶基因HES1,HES4,HEY1,HEY2的轉(zhuǎn)錄水平(p0.01),但是對OCT4的轉(zhuǎn)錄水平無明顯影響(p0.05)。相應(yīng)地,敲低SNW1能夠明顯促進(jìn)HES1,HES4,HEY1,HEY2的轉(zhuǎn)錄水平(p0.01),對OCT4的轉(zhuǎn)錄水平無明顯影響(p0.05)�；匮a(bǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(p0.01),在敲低RBPJ的情況下,SNW1不能夠?qū)otch信號通路進(jìn)行調(diào)節(jié)。結(jié)論:SNW1能夠抑制Notch信號通路,是通過與RBPJ相互作用進(jìn)行調(diào)控的。
【圖文】：

華 中 科 技 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文利用 Prism 8 (GraphPad)軟件進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果1. 神經(jīng)母細(xì)胞瘤中與Notch信號相關(guān)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子1.1 通過GEO數(shù)據(jù)庫，分析在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中與Notch信號通路相關(guān)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。通過 GEO 數(shù)據(jù)庫(GSE62564)分析 498 例數(shù)神經(jīng)母細(xì)胞瘤的病人，分析與神經(jīng)母細(xì)胞瘤進(jìn)展、分期、MYCN 擴(kuò)增相關(guān)的 Notch 信號相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，取其交集，我們得到了轉(zhuǎn)錄因子 MAML3 與 RBPJ，接下來進(jìn)一步分析這兩種轉(zhuǎn)錄因子生存意義的大小。圖（1.1A 與 B）

圖 1.2 該圖顯示 RBPJ 在神經(jīng)母細(xì)胞瘤進(jìn)展期、臨床高分期及 MYCN 擴(kuò)增患者表達(dá)水平增高。1.3 神經(jīng)母細(xì)組織標(biāo)本及細(xì)胞系中檢測 RBPJ 表達(dá)水平。收集臨床上神經(jīng)母細(xì)胞瘤節(jié)細(xì)胞神經(jīng)母細(xì)胞瘤、分化良好神經(jīng)母細(xì)胞瘤、低分化神經(jīng)母細(xì)胞瘤、未分化神經(jīng)母細(xì)胞瘤的組織標(biāo)，，WB 及 IHC 實(shí)驗(yàn)表面（圖 2.1A 與B），在未分化組織標(biāo)本中，RBPJ 蛋白水平明顯增高。在神經(jīng)母細(xì)胞系中 IMR-32中表達(dá)較高，SH-SY5Y 表達(dá)較低，而 SK-N-AS、SK-N-SH 中表達(dá)中等(圖 2.1 C)，因此我們選擇 SK-N-AS 和 SK-N-SH 來進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)研究。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R739.4

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本文編號：2637995