【摘要】：背景:短暫性腦缺血(TIA)的反復發(fā)作,在48 h內(nèi)發(fā)生缺血性腦病幾率大約為50%,危險系數(shù)比較大,成為缺血性腦病的威脅因素。而在溶栓時間窗內(nèi)通過影像學檢查不容易將TIA和缺血性腦病區(qū)分開來,而血液標志物具備了經(jīng)濟有效和無創(chuàng)性的優(yōu)點,并且可以用于疾病的診斷。因此本研究主要目的是為找到有效的血漿外泌體miRNA作為診斷TIA的血液標志物。方法:首先,制作大鼠大腦中動脈閉塞(MCAo)模擬大鼠TIA模型,收集造模后大鼠的血漿及腦脊液樣本,使用HE染色及TUNNEL染色對缺血后大鼠腦組織神經(jīng)元細胞的病理變化進行評估。其次,通過試劑盒從血漿和腦脊液樣本中提取外泌體總RNA,使用深度測序檢測大鼠血漿中的外泌體miRNA表達,并篩選出差異表達顯著的miRNA。第三,本研究通過實時定量聚合酶鏈反應(PCR)和數(shù)字PCR(ddPCR)分別檢測血漿和腦脊液中外泌體的miRNA表達水平,選擇血漿和腦脊液表達趨勢相對一致的外泌體miRNA,然后對其進行生物信息學分析。最后,通過制作(ROC)曲線和計算曲線下面積(AUC)以評估m(xù)iRNA在診斷大鼠中TIA中的價值。結(jié)果:第一,TUNEL染色結(jié)果最終提示缺血5分鐘組的腦組織切片上能觀察到的極少數(shù)量TUNEL陽性細胞,而缺血10分鐘的TUNEL陽性細胞的數(shù)量相對于缺血5分鐘陽性細胞數(shù)量多,缺血后2小時的腦組織切片上可觀察到TUNEL陽性細胞是數(shù)量最多的細胞。由此可知,缺血時間不一致則TUNEL染色后的陽性率也相對不一致,缺血5min和假手術(shù)組的陽性率低于缺血10 min組和缺血2 h的陽性率。HE染色結(jié)果提示假手術(shù)組腦組織切片上的神經(jīng)元細胞形狀、大小及結(jié)構(gòu)均正常;缺血5分鐘組開始出現(xiàn)部分的神經(jīng)元細胞萎縮,出現(xiàn)嗜酸性壞死,萎縮性壞死、細胞核固縮、深染;在缺血10分鐘組萎縮的神經(jīng)元細胞數(shù)量增多,胞核固縮明顯,核仁消失,萎縮的神經(jīng)元細胞數(shù)量較前增加,神經(jīng)元細胞結(jié)構(gòu)紊亂;缺血2小時組可見很多的神經(jīng)元細胞壞死,纖維破碎溶解、纖維網(wǎng)呈空泡化以及細胞間質(zhì)水腫。第二,我們通過透射電鏡、Nano-ZS鑒定外泌體樣本的形態(tài)、平均粒徑以及粒徑主峰均在Exosome的粒徑范圍內(nèi)(20 nm-200 nm)與Exosome的粒徑分布吻合,還有流式細胞儀外泌體表面標志物特異蛋白標志物CD63和CD81,結(jié)果提示陽性表達率在95%以上。第三,高通量測序檢測大鼠血漿外泌體總RNA的表達量,并選出rno-mi-450 b-5p通過PCR驗證其在腦脊液和血漿樣品中的表達水平,結(jié)果表明rno-miR-450 b-5p在兩樣本中表達趨勢相對一致。再通過生物信息學分析表明外泌體rnomiR-450b-5p可能參與腦缺血的發(fā)生發(fā)展。最后制作ROC顯曲線,并計算假手術(shù)組與缺血10分鐘組大鼠外泌體rno-miR-450 b-5 p的AUC面積為(0.880),而且外泌體rno-miR-450 b-5 p在缺血10分鐘與缺血2小時表達有差異。因此外泌體rno-miR-450b-5p對于診斷大鼠TIA具有較高的價值。結(jié)論:血漿外泌體rno-miR-450 b-5 p對于診斷大鼠短暫性腦缺血具有較高的價值,可能成為大鼠TIA的生物學標志物及治療靶點。
【圖文】：

圖 1 | （A）通過 TUNEL染色顯示的額頂葉皮質(zhì)區(qū)的代表性的組織病理學變化。（B）假手術(shù)組、缺血 5min 組、缺血 10min 組、缺血 2h 組在 TUNEL染色后陽性細胞比率的對比（* P <0.001）。 （C）H＆E 染色顯示額頂葉皮質(zhì)區(qū)的代表性組織病理學結(jié)果。 正常神經(jīng)元細胞（箭頭）和選擇性神經(jīng)元細胞死亡，散在的嗜酸性粒細胞（三角形）。Figure 1 | (A) Representativehistopathological changes in the cortex of the frontal parietal lobe as indicated by TUNEL staining. (B)

-D）Zetasizer Nano 系列 Nano-ZS 儀器分析 4個血漿及腦脊液樣本的的粒徑大小為 20nm-200nm，分布占 50％-60％。 （E-I）使用 BD A漿及腦脊液樣本中，，外泌體特異性抗體 CD63和 CD81表達水平，四 （J）透射電鏡下觀察外泌體的形狀及大小，用箭頭指出的結(jié)構(gòu)為外D) Zetasizer Nano Nano-ZS instrument analyzes the particle size and dibrospinal fluid samples. And it can be seen that the size of the exosomesibution accounts for 50%-60%. . (E-I) The expression levels of exosomeD81 in four plasma and cerebrospinal fluid samples were analyzed using the positive rate of four samples was higher than 95%. (J) The shape anrved under a transmission electron microscope, and the structure indicatarrow was an exosomes.漿外泌體 miRNA生物科技有限公司完成血漿外泌體 miRNA 的深度
【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R743.31

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