【摘要】：目的對(duì)漢族人群中的多巴反應(yīng)性肌張力障礙(DRD)患者的GTP環(huán)化水解酶1基因(GCH1)、酪氨酸羥化酶基因(TH)進(jìn)行測(cè)序,探究DRD發(fā)病與基因突變的關(guān)系,擴(kuò)充與該病相關(guān)的基因突變范圍。并且采用MLPA技術(shù)分析GCH1、TH、Epsilon-sarcoglycan編碼基因(SGCE)上是否存在外顯子缺失,進(jìn)一步探究DRD的遺傳學(xué)發(fā)病機(jī)制,以便更好的發(fā)揮輔助診斷的作用。方法收集4個(gè)DRD家系共8名患者及其5名無(wú)癥狀家屬、10名散發(fā)性DRD患者和40名正常對(duì)照者的外周血樣本,并記錄臨床資料。采用高鹽法提取其外周血全基因組DNA,對(duì)GCH1、TH基因上的所有外顯子和剪接點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,用Mutation Surveyor software(SOFTGENETICS)軟件對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列分析,檢測(cè)突變位點(diǎn)。當(dāng)發(fā)現(xiàn)存在基因突變,則與正�；虻脑撐稽c(diǎn)堿基序列進(jìn)行對(duì)比分析。然后進(jìn)一步對(duì)DNA樣品進(jìn)行磁珠純化,應(yīng)用多重連接依賴(lài)式探針擴(kuò)增(Multiple ligation-dependent probe amplification,MLPA)技術(shù)與實(shí)時(shí)定量PCR(Real time PCR)技術(shù)相結(jié)合,對(duì)GCH1、TH、SGC五基因共22個(gè)外顯子(GCH1基因6個(gè)外顯子,TH基因5個(gè)外顯子,SGCE基因11個(gè)外顯子)進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格依照MRC-Holland公司提供的技術(shù)方案SALSA P099-C1 GCH1-TH-SGCE進(jìn)行基因外顯子的定量。MLPA劑量值用Coffalyser程序計(jì)算。采用qPCR實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證MLPA結(jié)果,用SYBR Green熒光定量法在ABI 7500 Fast PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增,qPCR反應(yīng)結(jié)果采用ddCt法(ddCt值=mean±SD),通過(guò)與正常對(duì)照基因的Ct值進(jìn)行比較來(lái)計(jì)算基因表達(dá)的差異,分析GCH1外顯子缺失情況。結(jié)果1 9號(hào)家系中4名患者均檢出GCH1基因1號(hào)外顯子發(fā)生雜合點(diǎn)突變Ala98VaI(454CT),使編碼的丙氨酸(Alamine)變成纈氨酸(Valine)。1名男性同樣攜帶此突變,但沒(méi)有表現(xiàn)DRD癥狀。2 10號(hào)家系中1名34歲女性患者的GCH1基因2號(hào)外顯子發(fā)生突變Ile135Thr(37449TC),導(dǎo)致編碼的異亮氨酸(Isoleucine)變成蘇氨酸(Threnine)。該患者的父親和哥哥同樣攜帶此突變,雖然沒(méi)有明顯的DRD癥狀,但是患有抑郁癥。3 12號(hào)家系中,2名女性患者GCH1基因1號(hào)外顯子存在雜合突變Tyr75Cys(385AG)。她們的正常同胞姐妹沒(méi)有攜帶該突變。4 2名散發(fā)性DRD患者TH基因1號(hào)外顯子和12號(hào)外顯子發(fā)生兩種雜合突變Ser19Cys(75CG)、Gly397Arg(6127GA)。5 MLPA反應(yīng)結(jié)果:1名散發(fā)性DRD患者的GCH1基因1號(hào)外顯子上與142nt和254nt探針結(jié)合的目標(biāo)序列的相對(duì)峰值率(RPR)約為0.5,而正常的比值應(yīng)為0.75-1.25。表明出現(xiàn)雜合缺失。其余被檢測(cè)者的GCH1、TH、SGCE基因外顯子均未見(jiàn)缺失。6采用qPCR對(duì)MLPA結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果用ddCt法將患者與正常對(duì)照者基因Ct值進(jìn)行比較,用二者之間的相差來(lái)計(jì)算基因表達(dá)的差異,通過(guò)計(jì)算得出22號(hào)患者的GCH1基因1號(hào)外顯子ddCt值(mean±SD)為0.9,正常對(duì)照者ddCt值為0。表示22號(hào)患者GCH1基因1號(hào)外顯子出現(xiàn)缺失。結(jié)論1在漢族人群中,GCH1基因在家族性DRD患者中突變頻率相對(duì)較高。3個(gè)新的GCH1基因錯(cuò)義突變?cè)?個(gè)家系中被檢出,但有部分患者(多數(shù)為散發(fā)性患者)未檢出GCH1、TH突變;攜帶相同突變的家族性DRD患者的癥狀和發(fā)病年齡均表現(xiàn)出一定的差異性,因此,DRD具有不完全外顯性。基因篩查可以作為臨床診斷的輔助手段。2散發(fā)性DRD患者GCH1基因存在外顯子缺失,但出現(xiàn)頻率較低;對(duì)于未檢出基因突變的散發(fā)性DRD患者,有必要檢測(cè)GCH1基因是否存在缺失。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R746

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本文編號(hào)：2634652