【摘要】：目的:吉蘭-巴雷綜合征(Guillain-Barre syndrome,GBS)是一種自身免疫介導(dǎo)的周圍神經(jīng)病,以急性遲緩性癱瘓和腦脊液蛋白-細(xì)胞分離為特征,是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)病率相對(duì)較高、致殘疾較重的自身免疫性疾病。軸索型GBS是我國(guó)GBS最常見類型,急性運(yùn)動(dòng)軸索型神經(jīng)病(acute motor axonal neuropathy,AMAN)是軸索型GBS中常見類型。AMAN是一種與前驅(qū)感染密切相關(guān)的疾病,最常見的感染病原體是空腸彎曲菌。研究發(fā)現(xiàn),空腸彎曲菌外膜上的脂多糖與人軸索的神經(jīng)節(jié)苷脂存在分子模擬,產(chǎn)生的抗體破壞富含神經(jīng)節(jié)苷脂的周圍神經(jīng)誘發(fā)軸索變性而介導(dǎo)發(fā)病。AMAN的致病性抗體為抗GD1a抗體或抗GM1抗體,但是其具體機(jī)制尚不明確。目前治療GBS的方法主要有免疫球蛋白和血漿置換,但臨床資料表明此方法僅對(duì)大部分患者有效,仍有部分患者經(jīng)積極治療后遺留后遺癥甚至死亡。與其他類型的GBS相比,AMAN患者在治療后效果差、預(yù)后差。因此,研究AMAN的發(fā)病機(jī)制并找出治療該病的有效辦法是十分必要的。Neogenin是一種在各組織中表達(dá)廣泛的I型跨膜糖蛋白,屬于免疫球蛋白超家族。Neogenin在神經(jīng)系統(tǒng)及遷移、增值和分化旺盛的部位大量表達(dá)。Neogenin是一種軸索導(dǎo)向因子受體,其配體有神經(jīng)導(dǎo)向因子Netrin、排斥性導(dǎo)向分子RGM(Repulsive guidance molecule,RGM)等。Netrin 可通過(guò)與其特異性配體 Neogenin相互作用后介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的遷移和軸突的導(dǎo)向生長(zhǎng)。Neogenin和配體RGMa結(jié)合后可通過(guò)可誘導(dǎo)生長(zhǎng)錐的崩解,進(jìn)而抑制損傷后的軸索再生過(guò)程。大量研究證實(shí),Neogenin是調(diào)控神經(jīng)發(fā)生以及軸突導(dǎo)向的關(guān)鍵分子。然而,Neogenin是否與AMAN的發(fā)生、進(jìn)展有關(guān),目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)相關(guān)研究。本實(shí)驗(yàn)成功利用單梯度的OptiPrep分離液經(jīng)密度梯度離心獲得高純度小鼠脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元,選取AMAN的其中一種致病性抗體抗GD1a抗體進(jìn)行實(shí)驗(yàn),加入該抗體干預(yù)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元建立AMAN的細(xì)胞模型,通過(guò)軸索生長(zhǎng)測(cè)定、生長(zhǎng)錐崩解實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證AMAN患者血清中的抗GD1a抗體對(duì)體外培養(yǎng)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的影響,將抗GD1a抗體陽(yáng)性AMAN患者血清、健康人血清加入到運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中,檢測(cè)Neogenin的mRNA和蛋白的表達(dá)水平。本實(shí)驗(yàn)旨在探究抗GD1a抗體對(duì)小鼠脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元Neogenin表達(dá)的影響,探索Neogenin能否成為AMAN治療的新靶點(diǎn)。方法:本實(shí)驗(yàn)分離E13.5天的C57BL/6胎鼠脊髓,0.25%的胰酶消化成單個(gè)細(xì)胞,過(guò)濾去掉未消化好的組織團(tuán)塊,細(xì)胞懸液經(jīng)過(guò)OptiPrep分離液密度梯度離心后獲得脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元,加入無(wú)血清的NABG培養(yǎng)基爬片培養(yǎng),觀察不同時(shí)間點(diǎn)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài),免疫熒光雙標(biāo)法鑒定分離運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的純度。將分離的小鼠脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元加入抗GD1a抗體干預(yù)建立AMAN的細(xì)胞模型,不加任何干預(yù)的作為空白對(duì)照組,分別在培養(yǎng)36、48小時(shí)后,用Image-Pro Plus 6.0軟件對(duì)神經(jīng)元的軸突長(zhǎng)度進(jìn)行測(cè)定,在培養(yǎng)36小時(shí)后,免疫熒光法染色F-actin顯示生長(zhǎng)錐的形態(tài),計(jì)算生長(zhǎng)錐崩解的數(shù)量。利用免疫熒光檢測(cè)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元Neogenin的表達(dá)情況。將分離的小鼠脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元按照隨機(jī)原則分為三組,AMAN血清組(加入抗GD1a抗體陽(yáng)性的AMAN血清)、健康血清組(加入年齡和性別匹配的健康人血清)和空白對(duì)照組,培養(yǎng)36小時(shí)后,熒光定量PCR檢測(cè)Neogenin的mRNA的水平,Western blot檢測(cè)Neogenin蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果:1、分離的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元觀察到典型的神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)及軸突生長(zhǎng)。分離的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元在10分鐘-20分鐘左右完全貼壁,在接種12時(shí)后,運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞伸出了幾個(gè)短小的突起。培養(yǎng)至48小時(shí),神經(jīng)元細(xì)胞的延伸出了多個(gè)樹突及其分支。培養(yǎng)至72小時(shí)后,在相鄰神經(jīng)元之間形成纖維網(wǎng)絡(luò)。2、免疫熒光染色SMI-32抗體、ChAT抗體雙標(biāo)陽(yáng)性證明培養(yǎng)的細(xì)胞為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞,純度約為90%-95%。3、與空白對(duì)照組相比,36小時(shí)、48小時(shí)抗GD1a抗體干預(yù)組軸突長(zhǎng)度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。與空白對(duì)照組相比,36小時(shí)抗GD1a抗體干預(yù)組生長(zhǎng)錐的數(shù)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。4、與空白對(duì)照組相比,健康血清組Neogenin的mRNA表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.933),與健康血清組相比,AMAN血清組Neogenin的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001),Western blot檢測(cè)結(jié)果表明AMAN血清組Neogenin的蛋白水平亦顯著上調(diào)。結(jié)論:1、本實(shí)驗(yàn)成功探索出利用單梯度的OptiPrep分離液來(lái)分離小鼠脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的新方法,為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元相關(guān)的研究提供了依據(jù)。2、抗GD1a抗體對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的軸索生長(zhǎng)有抑制作用,對(duì)生長(zhǎng)錐的崩解有促進(jìn)作用。3、抗GD1a抗體顯著上調(diào)小鼠脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中Neogenin的表達(dá)。
【圖文】：

經(jīng)元細(xì)胞伸出了長(zhǎng)軸突，胞體變大，核仁明顯。培養(yǎng)４８小時(shí)后，神經(jīng)元細(xì)胞的逡逑延伸出了多個(gè)樹突及其分支。培養(yǎng)７２小時(shí)后，可見神經(jīng)元細(xì)胞廣泛的突起，其逡逑中一些還伸出了二級(jí)和三級(jí)分支，在相鄰神經(jīng)元之間形成的纖維網(wǎng)絡(luò)。見圖２。逡逑畫＿，，：１畫霸

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