【摘要】：本研究分為三部分進行實驗:實驗一:谷氨酸誘導HT22細胞發(fā)生Parthanatos死亡機制的研究目的:多聚(ADP-核糖)聚合酶1(PARP-1)依賴的細胞死亡,也稱為Parthanatos死亡,是一種新的獨特的細胞死亡方式,在癲癇研究領(lǐng)域中卻鮮有報道。本部分研究擬在癲癇體外模型中探討Parthanatos死亡是否存在于癲癇誘導的神經(jīng)元損傷機制中,為癲癇的神經(jīng)保護治療提供新的靶點。方法:體外培養(yǎng)小鼠海馬神經(jīng)元細胞系HT22細胞,使用CCK8法檢測GLU的不同濃度以及不同作用時間對HT22細胞損傷情況,以選取最理想的細胞損傷模型。利用PARP-1抑制劑PJ34和si RNA沉默PARP-1基因技術(shù)對GLU誘導的HT22細胞損傷進行干預,使用LDH釋放試驗、Western blot、免疫熒光、流式細胞術(shù)等技術(shù)觀察相關(guān)指標,探討其作用機制。結(jié)果:(1)GLU誘導HT22細胞發(fā)生損傷呈濃度和時間依賴性,隨著GLU作用時間的延長,細胞死亡率呈遞增趨勢(p0.01),細胞線粒體的膜電位進行性下降(p0.01),細胞內(nèi)PARP-1表達升高,PAR的合成增多,線粒體AIF發(fā)生核轉(zhuǎn)位增加;(2)與GLU作用HT22細胞12h和24h的死亡率相比,相應(yīng)的PJ34預處理均可明顯降低細胞的死亡率(12h,p0.05;24h,p0.01)。與此同時,PJ34的應(yīng)用可明顯降低GLU誘導的HT22細胞內(nèi)PARP-1的表達和PAR的合成,并減少線粒體AIF向核轉(zhuǎn)位。PJ34還可以減輕GLU誘導的HT22細胞內(nèi)線粒體膜電位的下降(p0.01);(3)si RNA沉默PARP-1基因后,可明顯減少GLU誘導的HT22細胞死亡(p0.01),并降低細胞內(nèi)PARP-1的表達和PAR的合成,減少線粒體AIF向核發(fā)生轉(zhuǎn)位,還會減輕GLU誘導的HT22細胞內(nèi)線粒體膜電位的下降(p0.01)。結(jié)論:(1)GLU誘導HT22細胞發(fā)生死亡呈濃度和時間依賴性;(2)GLU誘導的HT22細胞死亡存在Parthanatos死亡機制;(3)PARP-1可以作為神經(jīng)保護治療的潛在干預靶點。實驗二:氧化應(yīng)激在谷氨酸誘導HT22細胞發(fā)生Parthanatos死亡中的作用目的:探討谷氨酸誘導HT22產(chǎn)生的ROS與Parthanatos死亡的關(guān)系,明確ROS在Parthanatos死亡機制中的始動作用。方法:體外培養(yǎng)小鼠海馬神經(jīng)元細胞系HT22細胞,使用GLU誘導HT22細胞來模擬癲癇后細胞損傷體外模型。利用LDH釋放試驗、Western blot、流式細胞術(shù)、酶標法以及ELISA法進行細胞死亡率、ROS、8-OHd G、還原型谷胱甘肽(Glutathione,GSH)以及相關(guān)蛋白的檢測,明確氧化應(yīng)激在谷氨酸誘導HT22細胞發(fā)生Parthanatos死亡中的作用,并證實NAC預處理對細胞的保護作用。結(jié)果:(1)GLU誘導的HT22細胞生成的ROS和DNA損傷標志物8-OHd G的水平呈時間依賴性,NAC預處理可有效降低ROS的生成(p0.01)和8-OHd G的表達(p0.01),同時可以提高細胞內(nèi)GSH的水平(p0.01);(2)NAC預處理可以明顯減少GLU誘導的HT22細胞死亡(p0.01),同時降低GLU誘導HT22細胞內(nèi)PARP-1的表達和PAR的合成,并減少線粒體AIF向核轉(zhuǎn)位。結(jié)論:(1)ROS可能是GLU誘導HT22細胞發(fā)生Parthanatos死亡的始動因素;(2)NAC可能是通過提高細胞內(nèi)GSH水平發(fā)揮抗氧化損傷的作用;(3)NAC可有效抑制GLU誘導HT22細胞發(fā)生Parthanatos死亡。實驗三:NAC及PJ34對海人酸誘導的大鼠癲癇模型的神經(jīng)保護作用及機制研究目的:探討抗氧化劑NAC及PARP-1抑制劑PJ34在癲癇體內(nèi)研究中的作用及機制。方法:對Wistar大鼠右側(cè)杏仁核注射KA來制備大鼠癲癇模型,觀察大鼠行為學特征及病理學變化(HE染色)。應(yīng)用NAC及PJ34進行預處理,使用FJB染色、Western blot、酶標法以及ELISA等技術(shù)進行相關(guān)指標測定,來探索其在體內(nèi)癲癇模型中的作用機制。結(jié)果:(1)杏仁核注射KA誘導大鼠癲癇模型的行為學特征與人類癲癇發(fā)作相似,這種模型造模成功率高且死亡率低;(2)在KA點燃大鼠癲癇模型中,海馬組織CA1和CA3區(qū)可見神經(jīng)元的損害,其中以CA3區(qū)損害為主;(3)PJ34預處理可明顯減輕大鼠癲癇發(fā)作后海馬神經(jīng)元的損害,具有神經(jīng)保護作用(p0.01),并抑制海馬組織PARP-1的表達和PAR的合成,同時減少線粒體AIF向核轉(zhuǎn)位;(4)NAC預處理明顯減輕大鼠癲癇后海馬神經(jīng)元的損害(p0.01)以及DNA的損傷(p0.01),并增加海馬組織內(nèi)GSH的含量(p0.01),同時,NAC預處理可抑制海馬組織PARP-1的表達和PAR的合成,并減少線粒體AIF向核轉(zhuǎn)位。結(jié)論:(1)在KA點燃大鼠癲癇模型中,海馬組織病理改變以CA1和CA3區(qū)神經(jīng)元損害為主(CA3區(qū)更為嚴重);(2)PJ34對大鼠癲癇后海馬神經(jīng)元的損害具有保護作用,其可抑制海馬神經(jīng)元發(fā)生Parthanatos死亡;(3)NAC對大鼠癲癇后海馬神經(jīng)元的損害具有保護作用,其可能是通過提高組織GSH的量而減輕癲癇發(fā)作造成海馬組織的DNA損傷,另外,NAC亦可抑制海馬神經(jīng)元發(fā)生Parthanatos死亡。
【圖文】：

結(jié)果1 GLU 對 HT22 細胞增殖和毒性作用1.1 CCK-8 法檢測 GLU 作用時間梯度和濃度梯度對 HT22 細胞的抑制增值作為了研究 GLU 對 HT22 細胞增值率的影響，我們用 CCK-8 法檢測 HT22 細胞U 作用濃度梯度和作用時間梯度條件下的細胞增殖活力。如圖 2.1 所示，與對，GLU 的作用時間從 6h 延長到 24h，GLU 的作用濃度由 5mM 升高到 20mM，H的存活率明顯下降，提示 GLU 抑制 HT22 細胞增殖活性在一定范圍內(nèi)呈劑量賴性。在 GLU 作用 6h 時，HT22 細胞的存活率下降到 87.8%（5mM）、74%（106.5%（20mM）。在 GLU 作用 12h 時，HT22 細胞的存活率下降到 80.2%（5m%（10mM）和 41.3%（20mM）。在 GLU 作用 24h 時，，HT22 細胞的存活率下%（5mM）、22%（10mM）和 13.5%（20mM）。

吉 林 大 學 博 士 學 位 論 文放法檢測 GLU 作用時間梯度對 HT22 細胞的細胞LU 對 HT22 細胞殺傷作用的影響，我們用 LDH 釋放 GLU 作用時間梯度條件下的細胞殺傷情況。如圖 細胞的 6h、12h 和 24h 的死亡率分別為 25.2 ±4.8%GLU 對 HT22 細胞的殺傷作用呈時間依賴性。
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R742.1

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本文編號：2628347