【摘要】：本研究分為三部分進(jìn)行實(shí)驗(yàn):實(shí)驗(yàn)一:谷氨酸誘導(dǎo)HT22細(xì)胞發(fā)生Parthanatos死亡機(jī)制的研究目的:多聚(ADP-核糖)聚合酶1(PARP-1)依賴的細(xì)胞死亡,也稱為Parthanatos死亡,是一種新的獨(dú)特的細(xì)胞死亡方式,在癲癇研究領(lǐng)域中卻鮮有報(bào)道。本部分研究擬在癲癇體外模型中探討Parthanatos死亡是否存在于癲癇誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷機(jī)制中,為癲癇的神經(jīng)保護(hù)治療提供新的靶點(diǎn)。方法:體外培養(yǎng)小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系HT22細(xì)胞,使用CCK8法檢測(cè)GLU的不同濃度以及不同作用時(shí)間對(duì)HT22細(xì)胞損傷情況,以選取最理想的細(xì)胞損傷模型。利用PARP-1抑制劑PJ34和si RNA沉默PARP-1基因技術(shù)對(duì)GLU誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞損傷進(jìn)行干預(yù),使用LDH釋放試驗(yàn)、Western blot、免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)觀察相關(guān)指標(biāo),探討其作用機(jī)制。結(jié)果:(1)GLU誘導(dǎo)HT22細(xì)胞發(fā)生損傷呈濃度和時(shí)間依賴性,隨著GLU作用時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞死亡率呈遞增趨勢(shì)(p0.01),細(xì)胞線粒體的膜電位進(jìn)行性下降(p0.01),細(xì)胞內(nèi)PARP-1表達(dá)升高,PAR的合成增多,線粒體AIF發(fā)生核轉(zhuǎn)位增加;(2)與GLU作用HT22細(xì)胞12h和24h的死亡率相比,相應(yīng)的PJ34預(yù)處理均可明顯降低細(xì)胞的死亡率(12h,p0.05;24h,p0.01)。與此同時(shí),PJ34的應(yīng)用可明顯降低GLU誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞內(nèi)PARP-1的表達(dá)和PAR的合成,并減少線粒體AIF向核轉(zhuǎn)位。PJ34還可以減輕GLU誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位的下降(p0.01);(3)si RNA沉默PARP-1基因后,可明顯減少GLU誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞死亡(p0.01),并降低細(xì)胞內(nèi)PARP-1的表達(dá)和PAR的合成,減少線粒體AIF向核發(fā)生轉(zhuǎn)位,還會(huì)減輕GLU誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位的下降(p0.01)。結(jié)論:(1)GLU誘導(dǎo)HT22細(xì)胞發(fā)生死亡呈濃度和時(shí)間依賴性;(2)GLU誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞死亡存在Parthanatos死亡機(jī)制;(3)PARP-1可以作為神經(jīng)保護(hù)治療的潛在干預(yù)靶點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)二:氧化應(yīng)激在谷氨酸誘導(dǎo)HT22細(xì)胞發(fā)生Parthanatos死亡中的作用目的:探討谷氨酸誘導(dǎo)HT22產(chǎn)生的ROS與Parthanatos死亡的關(guān)系,明確ROS在Parthanatos死亡機(jī)制中的始動(dòng)作用。方法:體外培養(yǎng)小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系HT22細(xì)胞,使用GLU誘導(dǎo)HT22細(xì)胞來模擬癲癇后細(xì)胞損傷體外模型。利用LDH釋放試驗(yàn)、Western blot、流式細(xì)胞術(shù)、酶標(biāo)法以及ELISA法進(jìn)行細(xì)胞死亡率、ROS、8-OHd G、還原型谷胱甘肽(Glutathione,GSH)以及相關(guān)蛋白的檢測(cè),明確氧化應(yīng)激在谷氨酸誘導(dǎo)HT22細(xì)胞發(fā)生Parthanatos死亡中的作用,并證實(shí)NAC預(yù)處理對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用。結(jié)果:(1)GLU誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞生成的ROS和DNA損傷標(biāo)志物8-OHd G的水平呈時(shí)間依賴性,NAC預(yù)處理可有效降低ROS的生成(p0.01)和8-OHd G的表達(dá)(p0.01),同時(shí)可以提高細(xì)胞內(nèi)GSH的水平(p0.01);(2)NAC預(yù)處理可以明顯減少GLU誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞死亡(p0.01),同時(shí)降低GLU誘導(dǎo)HT22細(xì)胞內(nèi)PARP-1的表達(dá)和PAR的合成,并減少線粒體AIF向核轉(zhuǎn)位。結(jié)論:(1)ROS可能是GLU誘導(dǎo)HT22細(xì)胞發(fā)生Parthanatos死亡的始動(dòng)因素;(2)NAC可能是通過提高細(xì)胞內(nèi)GSH水平發(fā)揮抗氧化損傷的作用;(3)NAC可有效抑制GLU誘導(dǎo)HT22細(xì)胞發(fā)生Parthanatos死亡。實(shí)驗(yàn)三:NAC及PJ34對(duì)海人酸誘導(dǎo)的大鼠癲癇模型的神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制研究目的:探討抗氧化劑NAC及PARP-1抑制劑PJ34在癲癇體內(nèi)研究中的作用及機(jī)制。方法:對(duì)Wistar大鼠右側(cè)杏仁核注射KA來制備大鼠癲癇模型,觀察大鼠行為學(xué)特征及病理學(xué)變化(HE染色)。應(yīng)用NAC及PJ34進(jìn)行預(yù)處理,使用FJB染色、Western blot、酶標(biāo)法以及ELISA等技術(shù)進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測(cè)定,來探索其在體內(nèi)癲癇模型中的作用機(jī)制。結(jié)果:(1)杏仁核注射KA誘導(dǎo)大鼠癲癇模型的行為學(xué)特征與人類癲癇發(fā)作相似,這種模型造模成功率高且死亡率低;(2)在KA點(diǎn)燃大鼠癲癇模型中,海馬組織CA1和CA3區(qū)可見神經(jīng)元的損害,其中以CA3區(qū)損害為主;(3)PJ34預(yù)處理可明顯減輕大鼠癲癇發(fā)作后海馬神經(jīng)元的損害,具有神經(jīng)保護(hù)作用(p0.01),并抑制海馬組織PARP-1的表達(dá)和PAR的合成,同時(shí)減少線粒體AIF向核轉(zhuǎn)位;(4)NAC預(yù)處理明顯減輕大鼠癲癇后海馬神經(jīng)元的損害(p0.01)以及DNA的損傷(p0.01),并增加海馬組織內(nèi)GSH的含量(p0.01),同時(shí),NAC預(yù)處理可抑制海馬組織PARP-1的表達(dá)和PAR的合成,并減少線粒體AIF向核轉(zhuǎn)位。結(jié)論:(1)在KA點(diǎn)燃大鼠癲癇模型中,海馬組織病理改變以CA1和CA3區(qū)神經(jīng)元損害為主(CA3區(qū)更為嚴(yán)重);(2)PJ34對(duì)大鼠癲癇后海馬神經(jīng)元的損害具有保護(hù)作用,其可抑制海馬神經(jīng)元發(fā)生Parthanatos死亡;(3)NAC對(duì)大鼠癲癇后海馬神經(jīng)元的損害具有保護(hù)作用,其可能是通過提高組織GSH的量而減輕癲癇發(fā)作造成海馬組織的DNA損傷,另外,NAC亦可抑制海馬神經(jīng)元發(fā)生Parthanatos死亡。
【圖文】：

結(jié)果1 GLU 對(duì) HT22 細(xì)胞增殖和毒性作用1.1 CCK-8 法檢測(cè) GLU 作用時(shí)間梯度和濃度梯度對(duì) HT22 細(xì)胞的抑制增值作為了研究 GLU 對(duì) HT22 細(xì)胞增值率的影響，我們用 CCK-8 法檢測(cè) HT22 細(xì)胞U 作用濃度梯度和作用時(shí)間梯度條件下的細(xì)胞增殖活力。如圖 2.1 所示，與對(duì)，GLU 的作用時(shí)間從 6h 延長(zhǎng)到 24h，GLU 的作用濃度由 5mM 升高到 20mM，H的存活率明顯下降，提示 GLU 抑制 HT22 細(xì)胞增殖活性在一定范圍內(nèi)呈劑量賴性。在 GLU 作用 6h 時(shí)，HT22 細(xì)胞的存活率下降到 87.8%（5mM）、74%（106.5%（20mM）。在 GLU 作用 12h 時(shí)，HT22 細(xì)胞的存活率下降到 80.2%（5m%（10mM）和 41.3%（20mM）。在 GLU 作用 24h 時(shí)，，HT22 細(xì)胞的存活率下%（5mM）、22%（10mM）和 13.5%（20mM）。

吉 林 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 論 文放法檢測(cè) GLU 作用時(shí)間梯度對(duì) HT22 細(xì)胞的細(xì)胞LU 對(duì) HT22 細(xì)胞殺傷作用的影響，我們用 LDH 釋放 GLU 作用時(shí)間梯度條件下的細(xì)胞殺傷情況。如圖 細(xì)胞的 6h、12h 和 24h 的死亡率分別為 25.2 ±4.8%GLU 對(duì) HT22 細(xì)胞的殺傷作用呈時(shí)間依賴性。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R742.1

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