【摘要】：小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的主要免疫細(xì)胞,具有分化狀態(tài)與功能的高度可塑性。它們不僅在維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)中的作用十分關(guān)鍵,而且參與多種神經(jīng)相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展。有研究表明,小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)和動(dòng)態(tài)行為是其在不同生理與病理?xiàng)l件下分化狀態(tài)的直觀反映。使用活體顯微成像技術(shù),描繪小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)和動(dòng)態(tài)行為的變化規(guī)律,將為直觀地揭示其在不同疾病中的作用帶來可能。目前,癌癥威脅著人類的健康,而腫瘤轉(zhuǎn)移是癌癥極難根治的主要原因。由于腦結(jié)構(gòu)及功能的復(fù)雜性,腫瘤腦轉(zhuǎn)移具有治療難度大、風(fēng)險(xiǎn)高、預(yù)后不良的特點(diǎn)。神經(jīng)病理性疼痛是一種主要由神經(jīng)系統(tǒng)損傷造成的慢性疼痛,在一些慢性疾病(如癌癥中的骨縮、感染、自身免疫疾病、外傷、糖尿病等)的發(fā)展過程中也會(huì)伴隨發(fā)生,極大地影響了病人的生活質(zhì)量。然而,在這兩種疾病的漫長發(fā)展過程中,小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的分化狀態(tài)是如何改變的,并且發(fā)揮怎樣的功能,目前還并不清楚。本研究充分利用活體顯微成像方法的優(yōu)勢,旨在對(duì)腫瘤腦轉(zhuǎn)移及神經(jīng)病理性疼痛這兩種慢性疾病中小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)和動(dòng)態(tài)行為進(jìn)行長時(shí)程監(jiān)視,以期揭示其在這兩種疾病發(fā)展中所發(fā)揮的作用。主要結(jié)果如下所示:(1)首先,我們通過雙側(cè)顱窗窗口實(shí)現(xiàn)了對(duì)小鼠黑色素瘤腦轉(zhuǎn)移灶和正常腦組織的同時(shí)監(jiān)視。經(jīng)過長達(dá)3周的活體顯微成像,我們觀察到在黑色素瘤腦轉(zhuǎn)移的發(fā)展過程中小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)由靜息狀態(tài)下的典型分支狀轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨淖冃蜗x樣。成像數(shù)據(jù)的定量分析結(jié)果顯示相比正常腦組織,轉(zhuǎn)移灶中的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的胞體直徑增至其1.56倍,而細(xì)胞突起長度減少了1.68倍。這些細(xì)胞除了形態(tài)發(fā)生了變化外,細(xì)胞的數(shù)量及胞體的運(yùn)動(dòng)速度分別是對(duì)照組的1.57倍和2.36倍。此外我們綜合小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的胞體直徑及細(xì)胞突起長度信息,提出了可更直觀與全面反映小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活化程度的參數(shù)“分支參數(shù)”。這些結(jié)果說明在腫瘤細(xì)胞接種后的第5天開始,大量的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞已被活化,且隨著腫瘤轉(zhuǎn)移灶的發(fā)展至接種后第21天,它們始終保持著這一活化狀態(tài),且活化程度達(dá)到最高。(2)通過剔除小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,我們證實(shí)它們參與了黑色素瘤腦轉(zhuǎn)移灶的形成。同時(shí)這些小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在黑色素瘤腦轉(zhuǎn)移的發(fā)展中顯著上調(diào)了MMP3的表達(dá)。其中,高達(dá)94%的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)了MMP3,且相對(duì)腫瘤細(xì)胞,小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的MMP3是其114.2倍。小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞MMP3表達(dá)情況與血腦屏障完整性及小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活化參數(shù)的相關(guān)性分析顯示,這些MMP3一方面作為刺激分子促進(jìn)了小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的活化,另一方面也參與破壞血腦屏障完整性從而實(shí)現(xiàn)對(duì)黑色素瘤腦轉(zhuǎn)移發(fā)展的促進(jìn)作用。(3)通過坐骨神經(jīng)CCI損傷,建立了不同程度疼痛的小鼠模型,在實(shí)現(xiàn)腰椎L5段的脊髓窗安裝后,經(jīng)過長達(dá)2周的脊髓成像,我們觀察到小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)病理性疼痛發(fā)展中的動(dòng)態(tài)變化。通過比較不同程度疼痛小鼠及疼痛小鼠左右兩側(cè)脊髓段中的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,我們發(fā)現(xiàn),中重度疼痛小鼠脊髓中,小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在疼痛損傷后第2天已開始活化,它們的形態(tài)更傾向于變形蟲樣。而且至疼痛損傷后第14天,這些細(xì)胞仍然保持著活化的狀態(tài),同時(shí),細(xì)胞突起的運(yùn)動(dòng)速度降低,單位體積細(xì)胞數(shù)量是對(duì)照組的1.75倍。這些結(jié)果說明,疼痛損傷后,小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞能快速被活化,且疼痛發(fā)展過程中小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞持續(xù)的活化狀態(tài)提示其與神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)展持久且漫長的特點(diǎn)密切相關(guān)。(4)最后,為了探究后肢感覺皮層是如何參與神經(jīng)病理性疼痛的調(diào)控,通過無標(biāo)記、高分辨的光聲顯微成像系統(tǒng),我們對(duì)正常小鼠和疼痛小鼠的后肢感覺皮層血氧飽和度進(jìn)行了成像,結(jié)果顯示疼痛小鼠皮層血管中含氧血紅蛋白的比例更高。血氧飽和度更高的現(xiàn)象說明,在疼痛小鼠中,后肢感覺皮層中正在進(jìn)行活躍的物質(zhì)和能量交換,因此需要更多的氧分,并提示皮層中小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞也可能處于活化的狀態(tài),從而參與了神經(jīng)病理性疼痛的調(diào)控。綜上所述,本課題使用活體顯微成像技術(shù)監(jiān)測到,隨著黑色素瘤腦轉(zhuǎn)移及神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)展,小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞能夠被快速地活化,且在形態(tài)、動(dòng)態(tài)行為及分布上有了顯著性的改變,并通過傳統(tǒng)生物學(xué)手段及光聲顯微成像技術(shù),進(jìn)一步揭示了其在這兩種疾病中的作用,為相關(guān)機(jī)理研究提供了新證據(jù),并為這兩種疾病的治療提供了新思路。
【圖文】：

io-Hortega 發(fā)現(xiàn)的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。A，Pio del Rio-Hortega（1882-1945）；B，Rio-Ho支裝小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞；C，吞噬過程中小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)變化（A，具有粗大的；B，短小的細(xì)胞突起和膨大的胞體；C，肥大胞體及偽足；D 和 E，變形蟲樣及偽足了白細(xì)胞；G，吞噬了紅細(xì)胞；H，脂肪滴細(xì)胞，I，正在進(jìn)行有絲分裂的細(xì)胞）31。-1 Microglia discovered by Pio del Rio-Hortega. A, Pio del Rio-Hortega (1882-1945d microglia drawn by Pio del Rio-Hortega. C, Different morphology of microglia durintic activity (A, cell with thick, rough prolongations; B, cells with short prolongations cell body; C, hypertrophic cell with pseudopodia; D and E, amoeboid and pseudopodic form phagocytosed leukocyte; G, cell with numerous phagocytosed erythrocytes; H, fat-granule mitotic division)31.神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活化狀態(tài)與功能密切相關(guān)�；谠缙谌藗儗�(duì)小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞功發(fā)現(xiàn)，小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞能在外界刺激下轉(zhuǎn)變成具有某種特定功能的活化細(xì)形態(tài)會(huì)發(fā)生顯著性的改變32。隨著顯微成像技術(shù)的發(fā)展，人們觀察到活化的質(zhì)細(xì)胞相比監(jiān)視狀態(tài)下的細(xì)胞，運(yùn)動(dòng)等動(dòng)態(tài)行為也有顯著性的差別33。它們態(tài)和動(dòng)態(tài)的變化，都能夠作為評(píng)價(jià)小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活化狀態(tài)的標(biāo)準(zhǔn)。在 2el Nimmerjahn34等人在健康的小鼠腦組織中發(fā)現(xiàn)，小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是高速動(dòng)圖 1-2 所示。它們通過其高度分支的細(xì)胞突起通過伸出和回縮持續(xù)掃描周圍

華 中 科 技 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 論 文，并讓人們意識(shí)到其動(dòng)態(tài)的重要性。在隨后的研究中，不少研究者成像的方法揭示了小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在不同微環(huán)境中的作用35-38，如傷的腦組織活體顯微成像發(fā)現(xiàn)，小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞這種對(duì)損傷做出的應(yīng)是依賴于 ATP 的；通過對(duì)中風(fēng)的小鼠腦組織進(jìn)行成像發(fā)現(xiàn)，小神擇性地清除功能紊亂的神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)從而實(shí)現(xiàn)對(duì)腦組織的保護(hù)；而在育過程中，小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞能夠誘導(dǎo)突觸的形成；另外，通過對(duì)單長達(dá) 15 個(gè)月的成像發(fā)現(xiàn)，其在腦組織中的較長的生命周期與各種都有緊密聯(lián)系。這些活體顯微成像的結(jié)果揭示了小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞動(dòng)腦組織微環(huán)境中的變化，從而實(shí)現(xiàn)正常監(jiān)視或損傷修復(fù)和應(yīng)急，，調(diào)化疾病發(fā)生發(fā)展等功能。因此，小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)及動(dòng)態(tài)的變化狀態(tài)的改變。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R739.5;R741

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