【摘要】：缺氧缺血性腦損傷(hypoxic ischemic brain damage,HIBD)指腦組織部分或完全缺氧,腦血流減少或暫停所致的腦損傷,既發(fā)生于各種圍生期窒息引起的新生兒腦損傷,也發(fā)生于冠心病,心肌梗塞,腦中風(fēng)等引起的老年人缺氧損傷,也發(fā)生于其他的年齡段,是引起神經(jīng)系統(tǒng)傷殘的主要原因,也是常見(jiàn)的臨床疾病。缺氧導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞凋亡是其發(fā)生的重要原因之一。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor,HIF-1α)是一種分布和作用十分廣泛的真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子,是低氧應(yīng)答時(shí)基因表達(dá)和恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的關(guān)鍵因子。缺氧會(huì)導(dǎo)致HIF-1α表達(dá)增加,進(jìn)而導(dǎo)致下游一系列基因表達(dá)變化,引發(fā)凋亡等生物學(xué)效應(yīng)。前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9,PCSK9)也叫神經(jīng)凋亡調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化酶1(neural apoptosis regulated convertase 1,NARC-1),通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞表面低密度脂蛋白受體,進(jìn)而在膽固醇代謝中發(fā)揮重要作用。前期研究發(fā)現(xiàn)PCSK9與神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān),且生物信息學(xué)分析PCSK9啟動(dòng)子區(qū)域有HIF-1α結(jié)合位點(diǎn)。氯化鈷為一種低氧模擬試劑,常用于體外誘導(dǎo)細(xì)胞缺氧。本課題旨在研究缺氧是否通過(guò)調(diào)節(jié)HIF-1α表達(dá)進(jìn)而上調(diào)PCSK9表達(dá),從而促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡,進(jìn)而探索缺氧導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)損傷的機(jī)制。第一部分:氯化鈷(Co Cl2)對(duì)PC12細(xì)胞PCSK9、HIF-1α表達(dá)的影響以及對(duì)PC12細(xì)胞凋亡的影響。目的:探討氯化鈷(Co Cl2)能否通過(guò)調(diào)節(jié)PCSK9、HIF-1α的表達(dá)影響PC12神經(jīng)細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)方法:分別用0μmol/L、125μmol/L、250μmol/L、500μmol/L的Co Cl2處理PC12細(xì)胞24小時(shí)后,用Western blot檢測(cè)PC12細(xì)胞中PCSK9及HIF-1α蛋白的表達(dá)。用250μmol/L Co Cl2處理PC12細(xì)胞不同時(shí)間(0h、6h、12h、24h)后,Western blot檢測(cè)PC12細(xì)胞中PCSK9及HIF-1α蛋白的表達(dá)。Hoechst33258染色以及流式細(xì)胞儀檢測(cè)Co Cl2對(duì)PC12細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果:隨著Co Cl2處理濃度的增高,PC12細(xì)胞中PCSK9的表達(dá)呈濃度依賴性增高,其中250μmol/L和500μmol/L的Co Cl2處理組增高較為顯著;HIF-1α蛋白的表達(dá)呈濃度依賴性增高。其中250μmol/L和500μmol/L的Co Cl2處理組增高較為顯著;同時(shí),Co Cl2也能呈濃度依賴性增加PC12細(xì)胞的凋亡。與0h相比,隨著Co Cl2作用時(shí)間的延長(zhǎng),PC12細(xì)胞中PCSK9的蛋白表達(dá)呈時(shí)間依賴性升高,其中以24h升高最為顯著;HIF-1α蛋白的表達(dá)呈時(shí)間依賴性增高,其中以24h升高最為顯著。小結(jié):Co Cl2呈濃度和時(shí)間依賴性上調(diào)PC12細(xì)胞中PCSK9的表達(dá)和HIF-1α蛋白的表達(dá);此外,它也能呈濃度依賴性促進(jìn)PC12細(xì)胞的凋亡。第二部分:HIF-1α表達(dá)改變對(duì)PC12細(xì)胞PCSK9、HIF-1α的表達(dá)以及對(duì)PC12細(xì)胞凋亡的影響。目的:探討HIF-1α蛋白表達(dá)的改變能否對(duì)PCSK9蛋白表達(dá)產(chǎn)生影響進(jìn)而影響PC12細(xì)胞的凋亡。實(shí)驗(yàn)方法:設(shè)立空白對(duì)照組,濃度分別為0μmol/L、250μmol/L、500μmol/L、1000μmol/L的HIF-1α激動(dòng)劑DMOG共孵育250μmol/L Co Cl2,作用于PC12細(xì)胞24小時(shí)后,用Western blot檢測(cè)PC12細(xì)胞中PCSK9、HIF-1α、Caspase3及Caspase9蛋白的表達(dá);用Hoechst33258染色以及流式細(xì)胞儀檢測(cè)DMOG對(duì)PC12細(xì)胞凋亡的影響。設(shè)立空白對(duì)照組,濃度分別為0μmol/L、1μmol/L、10μmol/L、50μmol/L的HIF-1α抑制劑YC-1共孵育250μmol/L Co Cl2,作用于PC12細(xì)胞24小時(shí)后,用Western blot檢測(cè)PC12細(xì)胞中PCSK9、HIF-1α、Caspase3及Caspase9蛋白的表達(dá);用Hoechst33258染色以及流式細(xì)胞儀檢測(cè)YC-1對(duì)PC12細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果:隨著DMOG處理濃度的增高,PC12細(xì)胞中HIF-1α和PCSK9的表達(dá)呈濃度依賴性增高,其中250μmol/L、500μmol/L與0μmol/L相比PCSK9及HIF-1α蛋白的升高較為顯著;凋亡蛋白Caspase3及Caspase9表達(dá)呈濃度依賴性降低,PC12細(xì)胞的凋亡率也呈濃度依賴性降低,其中1000μmol/L的DMOG處理組降低最為顯著;同時(shí),隨著YC-1處理濃度的增高,PC12細(xì)胞中HIF-1α和PCSK9的表達(dá)呈濃度依賴性降低,凋亡蛋白Caspase3及Caspase9表達(dá)呈濃度依賴性升高,YC-1也呈濃度依賴性增加PC12細(xì)胞的凋亡。小結(jié):DMOG呈濃度依賴性上調(diào)PC12細(xì)胞中PCSK9的表達(dá)和HIF-1α蛋白的表達(dá);此外,它也能呈濃度依賴性降低PC12細(xì)胞的凋亡。YC-1呈濃度依賴性下調(diào)PC12細(xì)胞中PCSK9蛋白的表達(dá)和HIF-1α蛋白的表達(dá);此外,它也能呈濃度依賴性促進(jìn)PC12細(xì)胞的凋亡。第三部分:PCSK9 si RNA對(duì)PC12細(xì)胞PCSK9的表達(dá)以及對(duì)PC12細(xì)胞凋亡的影響。目的:探討PCSK9蛋白表達(dá)的改變能否對(duì)缺氧條件下PC12細(xì)胞的凋亡產(chǎn)生影響實(shí)驗(yàn)方法:用有效濃度的PCSK9 si RNA轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞36h后,加入含有250μmol/L的Co Cl2的無(wú)血清培養(yǎng)基處理PC12細(xì)胞24小時(shí)。Western blot分別檢測(cè)PC12細(xì)胞中PCSK9、HIF-1α、Caspase3及Caspase9蛋白的表達(dá)量;用Hoechst33258染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。結(jié)果:將有效濃度的PCSK9 si RNA轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞36h后,再用含250μmol/L的Co Cl2的無(wú)血清培養(yǎng)基處理PC12細(xì)胞24小時(shí)。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染PCSK9 si RNA組HIF-1α蛋白表達(dá)降低;Hoechst33258染色及流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染PCSK9 si RNA組凋亡明顯被抑制。小結(jié):PCSK9 si RNA抑制了250μmol/L的氯化鈷引起的神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。結(jié)論:缺氧誘導(dǎo)HIF-1α的產(chǎn)生促進(jìn)PCSK9的表達(dá)調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞凋亡。
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第 4 章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果低 PC12 細(xì)胞活力增加細(xì)胞缺氧損傷用的化學(xué)缺氧試劑，具有簡(jiǎn)單，方便易操作的特點(diǎn)。L 的濃液，使用之前進(jìn)行稀釋。臺(tái)盼藍(lán)為細(xì)胞活性染性以及細(xì)胞存活率。分別用 0μmol/L、 125μmol/L、oCl2處理PC12細(xì)胞24小時(shí)后，用臺(tái)盼藍(lán)溶液進(jìn)行染，在倒置顯微鏡下觀察。結(jié)果顯示，，隨著 CoCl2濃度的染色的細(xì)胞逐漸增多，細(xì)胞變小變圓皺縮突觸收縮低 PC12 細(xì)胞活力，增加 PC12 細(xì)胞缺氧損傷。

圖 4.2.1 不同濃度 CoCl2對(duì) PC12 細(xì)胞中 *P <04.2.2 250μmol/L CoCl2處理 PC12PCSK9 表達(dá)用 250μmol/L CoCl2處理 PC12 細(xì)胞細(xì)胞中 HIF-1α和 PCSK9 中的蛋白表達(dá)理時(shí)間的增多，PC12 細(xì)胞中 HIF-1α和24h 處理組增加最為明顯（圖 4.5）。
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R742

【參考文獻(xiàn)】

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1 劉文強(qiáng);徐艷;韓愛(ài)民;楊倩倩;王軍;;參附注射液對(duì)缺氧缺血性腦損傷新生大鼠皮質(zhì)區(qū)鈣網(wǎng)蛋白表達(dá)及神經(jīng)元凋亡的影響[J];中國(guó)當(dāng)代兒科雜志;2015年03期

2 唐志晗;武春艷;任重;劉錄山;姜志勝;;PCSK9-siRNA對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的THP-1源性巨噬細(xì)胞凋亡中Caspase-3表達(dá)的影響[J];廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2011年01期

3 唐志晗;武春艷;任重;劉錄山;姜志勝;;PCSK9-siRNA在抗ox-LDL誘導(dǎo)的THP-1源性巨噬細(xì)胞凋亡中對(duì)Bax、Bcl-2表達(dá)的影響[J];中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志;2011年01期

4 李麗華;屈藝;張莉;毛萌;母得志;;HIF-1α表達(dá)在新生大鼠缺氧/缺氧缺血性腦損傷神經(jīng)元凋亡中的作用[J];四川大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2008年06期

本文編號(hào)：2618842