【摘要】：動(dòng)脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血(aneurysmal subarachnoid hemorrhage,aSAH)作為腦血管疾病中的一種,約占所有自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血的85%左右,嚴(yán)重威脅的人類的健康。aSAH發(fā)病兇險(xiǎn),病死率高,然而在通常情況下,很難預(yù)測(cè)顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的生長和破裂,對(duì)發(fā)現(xiàn)和治療造成了極大的困擾。近年來,結(jié)合形態(tài)學(xué)指標(biāo)以及血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)采用數(shù)值模擬計(jì)算流體動(dòng)力技術(shù)發(fā)現(xiàn)高壁面切應(yīng)力與顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的生長和破裂相關(guān)。血流動(dòng)力學(xué)的變化僅僅是動(dòng)脈瘤生長和破裂的始動(dòng)因素,其如何通過“力學(xué)改變”進(jìn)一步演化成為“病理改變”仍為該領(lǐng)域的一個(gè)難點(diǎn)。LOX(賴氨酰氧化酶)作為生物體內(nèi)膠原纖維和彈性纖維活化和表達(dá)過程中一種重要的催化酶,其異常表達(dá)與血管壁破壞性重構(gòu)的病理變化(血管壁細(xì)胞外基質(zhì)的降解)密切相關(guān)。我們通過前期預(yù)實(shí)驗(yàn)(國家自然基金面上項(xiàng)目81471189)也發(fā)現(xiàn)LOX在動(dòng)脈瘤患者中有異常表達(dá)。因此,我們進(jìn)一步設(shè)計(jì)該實(shí)驗(yàn)來初步探索LOX在血流動(dòng)力學(xué)誘導(dǎo)的顱內(nèi)動(dòng)脈瘤生成中的作用。目前國內(nèi)外尚未見類似的研究。本研究的主要目的有二:1、細(xì)胞水平探索剪切力變化對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞LOX表達(dá)的影響;2、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究LOX與血流動(dòng)力學(xué)誘導(dǎo)的顱內(nèi)動(dòng)脈瘤生成之間的關(guān)系。第一部分細(xì)胞水平探索剪切力變化對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞LOX表達(dá)的影響目的:在細(xì)胞水平探索剪切力變化對(duì)大鼠內(nèi)皮細(xì)胞LOX表達(dá)的影響。方法:提取原代SD大鼠顱內(nèi)動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),并將其分成靜止組(0dyn/cm~2)、低剪切力組(12 dyn/cm~2)、正常剪切力組(24 dyn/cm~2)和高剪切力組(36dyn/cm~2),將其放入平行板流動(dòng)小室內(nèi)通過智能型蠕動(dòng)泵給予穩(wěn)定的剪切力刺激,培養(yǎng)24 h后測(cè)定LOX的mRNA表達(dá)情況,LOX蛋白水平的表達(dá)情況以及細(xì)胞凋亡的情況。結(jié)果:1、LOX蛋白水平的表達(dá)在各組間均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異。靜止細(xì)胞少量表達(dá),正常剪切力組表達(dá)最低(p0.05);低剪切力和高剪切力組有明顯增加(p0.05),且在高剪切力作用下,表達(dá)最明顯。2、LOX的mRNA表達(dá)在靜止細(xì)胞中有少量表達(dá),在正常剪切力作用下表達(dá)受一定程度抑制(p0.05)。高剪切力作用下,表達(dá)最顯著(p0.05)。3、Cleaved-Caspase 3蛋白的表達(dá)水平,以靜止組為參考時(shí),低剪切力和高剪切力組表達(dá)均有增加(p0.05),而與正常剪切力組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。當(dāng)以高剪切力組為參考時(shí),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。同時(shí)可以發(fā)現(xiàn),在高剪切力作用下,Cleaved-Caspase 3蛋白的表達(dá)最明顯。結(jié)論:在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,LOX蛋白水平的表達(dá)在高剪切力作用下時(shí)顯著升高;LOX的mRNA表達(dá)也顯著升高;同時(shí)Cleaved-Caspase 3蛋白表達(dá)的增加也最為明顯。提示高剪切力刺激導(dǎo)致LOX表達(dá)增加,并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。第二部分動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究LOX與血流動(dòng)力學(xué)誘導(dǎo)的顱內(nèi)動(dòng)脈瘤生成之間的關(guān)系目的:1、用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果;2、構(gòu)建干擾LOX表達(dá)的腺相關(guān)病毒,特異性干擾LOX的表達(dá);3、研究LOX與血流動(dòng)力學(xué)誘導(dǎo)的顱內(nèi)動(dòng)脈瘤生成之間的關(guān)系。方法:1、SD大鼠66只,隨機(jī)分成空白對(duì)照組(n=18)、假手術(shù)組(n=24)、模型組(n=24),建模組通過顯微外科技術(shù)建立血流動(dòng)力學(xué)模型;假手術(shù)組僅做血管探查,不做血管結(jié)扎;空白對(duì)照組不做任何處理;3個(gè)月后處死制備大鼠顱內(nèi)供血?jiǎng)用}樹脂鑄型標(biāo)本、免疫組化檢測(cè)腦血管LOX蛋白水平的表達(dá)情況、Realtime-PCR技術(shù)測(cè)定LOX的mRNA表達(dá)情況;2、篩選外源有效RNAi載體并進(jìn)行腺相關(guān)病毒包裝,特異性干擾LOX基因表達(dá);3、再次選取SD大鼠72只,隨機(jī)分成模型組(n=24)、干擾組(n=24)和陰性對(duì)照組(n=24),所有大鼠均建立血流動(dòng)力學(xué)模型,模型組僅單純建模,干擾組給予尾靜脈注射腺相關(guān)病毒,陰性對(duì)照組給予尾靜脈注射陰性對(duì)照腺相關(guān)病毒,3個(gè)月后處死制備大鼠顱內(nèi)供血?jiǎng)用}樹脂鑄型標(biāo)本、免疫組化檢測(cè)腦血管LOX蛋白水平的表達(dá)情況、Realtime-PCR技術(shù)測(cè)定LOX的mRNA表達(dá)情況。結(jié)果:1、模型組較假手術(shù)組以及空白對(duì)照組成瘤率明顯升高,兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),免疫組化提示腦血管LOX蛋白水平的表達(dá)明顯增加(p0.05),Realtime-PCR技術(shù)測(cè)定LOX的mRNA表達(dá)明顯增加(p0.05);2、構(gòu)建腺相關(guān)病毒,表達(dá)良好,平均滴度為5.05E+12;3、給予腺相關(guān)病毒特異性干擾LOX表達(dá)后,腦血管LOX蛋白水平的表達(dá)以及mRNA的表達(dá)均有所降低(p0.05)。結(jié)論:在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果總體變化趨勢(shì)與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)一致。高剪切力的刺激可以導(dǎo)致顱內(nèi)動(dòng)脈LOX基因表達(dá)的增加以及LOX蛋白水平表達(dá)的增加,同時(shí)導(dǎo)致顱內(nèi)供血?jiǎng)用}瘤樣改變,特異性抑制LOX基因的表達(dá)后LOX蛋白水平的表達(dá)以及mRNA的表達(dá)顯著降低,瘤樣改變可以得到有效的抑制。小結(jié):高剪切力刺激可以導(dǎo)致LOX基因和LOX蛋白水平表達(dá)的顯著增加,在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中均得到了驗(yàn)證,體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)提示可以導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,動(dòng)物在體實(shí)驗(yàn)可以導(dǎo)致大鼠前交通復(fù)合體動(dòng)脈成瘤率增加;特異性抑制LOX的表達(dá)后可以使成瘤率降低,對(duì)動(dòng)脈瘤發(fā)生發(fā)展過程起到一定的抑制作用。本研究初步闡明了LOX與血流動(dòng)力學(xué)誘導(dǎo)的顱內(nèi)動(dòng)脈瘤生成之間的關(guān)系,后期可進(jìn)行具體機(jī)制的研究,從而有望提高我國動(dòng)脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血的防治水平。
【圖文】：

不同剪切力刺激內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)過程。 A 為生長在載玻片上大小的蠕動(dòng)泵；C 為將載玻片放入 Parallel-PlateFlowCham為將整體放入恒溫培養(yǎng)箱中。estern Blot 實(shí)驗(yàn)檢測(cè) LOX 蛋白水平的表達(dá)取總蛋白，我們將載玻片無菌取下后用 PBS 沖洗 2 次，用uffer 裂解，用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞轉(zhuǎn)入 EP 管中，將其放在冰上，然后用超聲破碎細(xì)胞，參數(shù)為 200 W，共 4 次，每次持s；離心后結(jié)束后，用 BCA 法測(cè)定上清液的蛋白濃度。調(diào)整L，-80℃冰箱中。如果是組織的話采用如下方法：在干冰上鐘內(nèi)加入PMSF，采用等量的RIPA裂解液，使PMSF的最終 20mg 組織加入 150-250 uL 裂解液的比列冰浴裂解（因?yàn)榭迹虼宋覀冞m當(dāng)減少了裂解液的用量，從而來保證獲取高濃勻漿，待全裂解后，給予離心（參數(shù)：10000g，時(shí)間 5min，下冷藏，備用）；然后根據(jù)目標(biāo)蛋白的分子量制備不同濃度

原代大鼠顱內(nèi)動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞 vWF 免疫熒光鑒定。1：vWF；：倒置顯微鏡下內(nèi)皮細(xì)胞生長情況。（×200））采用 western blot 檢測(cè)不同剪切力刺激下，L情況部分研究中，根據(jù)既往相關(guān)研究結(jié)果，我們將實(shí)驗(yàn)分為靜止組組和高剪切力組，并設(shè)置剪切力大小分別為 0 dyn/cm2、16dyn/cm2。用智能蠕動(dòng)泵進(jìn)行穩(wěn)定的流量控制，在持續(xù)給予集載玻片上的細(xì)胞。分別以 Western blotting 檢測(cè)各組 LOXern blotting（圖 1-3）實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：LOX 蛋白水平的表達(dá)在異。以靜止組為參考，低剪切力和高剪切力組 LOX 蛋白水p＜0.05），正常剪切力組 LOX 蛋白水平的表達(dá)有降低的趨正常剪切力與高剪切力和低剪切力組，兩者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)較高剪切力組和低剪切力組，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R743

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 劉勇軍;王萍萍;馬婕;歐陽彬;陳娟;管向東;;改良大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)技術(shù)及細(xì)胞鑒定[J];中華損傷與修復(fù)雜志(電子版);2014年01期

2 呂楠;黃清海;;血流導(dǎo)向裝置對(duì)動(dòng)脈瘤血流動(dòng)力學(xué)影響的數(shù)值模擬研究進(jìn)展[J];中國腦血管病雜志;2013年10期

3 徐瑾瑜;鄧本強(qiáng);方亦斌;于瀛;程吉勇;王奎重;黃清海;劉建民;;置入虛擬及真實(shí)血流導(dǎo)向裝置后兔動(dòng)脈瘤模型血流動(dòng)力學(xué)的數(shù)值模擬研究[J];中國腦血管病雜志;2013年10期

4 姜智,劉煥星,亓久生,張榮銀,劉愛華;低氧及丹參對(duì)肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)皮素和一氧化氮釋放的影響[J];中華內(nèi)科雜志;1997年11期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 于瀛;鈣離子激活鉀通道KCa3.1在血流動(dòng)力學(xué)誘導(dǎo)的顱內(nèi)動(dòng)脈瘤生成機(jī)制中的作用研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2015年

，

本文編號(hào)：2617887