【摘要】：膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma,GBM)為原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中最常見、治療效果最差的一類惡性腫瘤。目前,多種治療手段被應(yīng)用于GBM的治療,包括使用不同治療靶點(diǎn)的單克隆藥物、烷化劑化療藥物、放射治療、腫瘤治療電場(tumor treatment field,TTField)等。但是,即便在標(biāo)準(zhǔn)治療方案基礎(chǔ)上聯(lián)合多種治療手段,GBM患者的中位生存期仍然很短。GBM的特點(diǎn)之一是具有極豐富的供瘤血管。離體或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均已證明,抑制腫瘤血管生成可以有效地控制腫瘤演進(jìn)并延長生存期,但是目前臨床應(yīng)用的貝伐單抗(bevacizumab,BVZ)等抗血管治療藥物對原發(fā)性GBM的治療效果并不理想。GBM干細(xì)胞(glioblastoma stem cell,GSC)是GBM中能夠向多種成熟細(xì)胞類型分化的一類膠質(zhì)瘤細(xì)胞,其對放療、化療耐受性強(qiáng),并且具有較強(qiáng)的促血管生成能力。GSC在GBM演進(jìn)過程中發(fā)揮重要作用,同時(shí)也是GBM復(fù)發(fā)的重要因素之一。因此,進(jìn)一步了解GSC所具有的獨(dú)特病理、生理學(xué)特性將為治療GBM提供更廣泛的思路。YKL-40和VEGF是兩種重要的分泌型促血管生成因子,其在GBM促血管生成中的作用已被證實(shí),但是它們在GSC促血管生成作用中的地位尚未明確。此外,GBM是一類具有高度異質(zhì)性的腫瘤:根據(jù)基因表達(dá)普的不同其被分為四種類型,即:經(jīng)典型(classical)、神經(jīng)元型(neuronal)、前神經(jīng)元型(Preneuronal)及間質(zhì)型(mesenchymal);根據(jù)甲基化模式不同又被分為膠質(zhì)瘤甲基化表型(G-CIMP)陽性和陰性兩種。因此,根據(jù)膠質(zhì)瘤類型的不同來細(xì)致了解各個(gè)類型膠質(zhì)瘤的惡性特點(diǎn)對于GBM的精準(zhǔn)治療具有重要意義。O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(MGMT)的啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)一直被認(rèn)為是使用烷化劑藥物治療GBM的指征之一,MGMT啟動(dòng)子低甲基化意味著其對烷化劑化療藥物治療敏感性低。但是目前發(fā)現(xiàn)MGMT啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)也與未應(yīng)用烷化劑治療的GBM患者的預(yù)后有關(guān),提示不同MGMT啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)可能代表具有不同預(yù)后特點(diǎn)和惡性征象的GBM甲基化相關(guān)亞型。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶-1(DNMT1)作為維持基因組甲基化狀態(tài)的重要酶之一,其表達(dá)的變化將直接影響全基因組的甲基化模式。那么DNMT1是否可以影響GSC的惡性特點(diǎn)?目前尚未有相關(guān)研究�！灸康摹�1)探討血清誘導(dǎo)干細(xì)胞分化后其血管生成能力的變化情況,并了解hGSC中YKL-40對VEGF表達(dá)的影響。2)探討DNMT1對MGMT啟動(dòng)子低甲基化狀態(tài)hGSC的血管生成能力的影響。同時(shí)探索DNMT1過表達(dá)對YKL-40與VEGF之間的關(guān)系的影響�！痉椒ā�1)運(yùn)用標(biāo)準(zhǔn)干細(xì)胞分離、與篩選的方法從人GBM樣本中提取干細(xì)胞,使用免疫熒光染色、PCR、Western blot對“干性”標(biāo)記物進(jìn)行檢測。通過血清誘導(dǎo)干細(xì)胞分化,檢測分化前后其促血管生成能力變化情況,了解YKL-40和VEGF的表達(dá)與分泌情況。檢測實(shí)驗(yàn)選用的干細(xì)胞MGMT啟動(dòng)子甲基化水平,并使用慢病毒抑制hGSC的YKL-40表達(dá),明確VEGF的表達(dá)變化情況。2)使用腺病毒上調(diào)MGMT啟動(dòng)子低甲基化狀態(tài)hGSC的DNMT1表達(dá),明確YKL-40、VEGF、MGMT的表達(dá)情況。隨后在下調(diào)YKL-40的表達(dá)同時(shí)上調(diào)DNMT1的表達(dá)后,觀察VEGF的表達(dá)情況。【結(jié)果】分離的hGSC高表達(dá)“干性”標(biāo)記物,其促血管生成作用要強(qiáng)于分化后的hDGC。hGSC中YKL-40和VEGF表達(dá)高于hDGC。在MGMT啟動(dòng)子低甲基化的hGSC中,YKL-40可促進(jìn)VEGF分泌。當(dāng)上調(diào)DNMT1增加MGMT啟動(dòng)子低甲基化的hGSC的DNA甲基化水平后,hGSC的MGMT、VEGF、YKL-40表達(dá)均下降,此時(shí)降低YKL-40可以促進(jìn)VEGF表達(dá)�！窘Y(jié)論】本研究認(rèn)為,hGSC較之一般分化的GBM具有更強(qiáng)的血管生成能力,并且這種能力與腫瘤自身特定的甲基化模式相關(guān)。DNMT1可以通過增加MGMT啟動(dòng)子低甲基化狀態(tài)hGSC的甲基化水平降低腫瘤促血管生成能力及某些惡性特點(diǎn)。
【圖文】：

圖 1.3.1 A. 分離細(xì)胞株 WZ27、WZ31 克隆球照片； B. 免疫熒光檢測克隆球CD133 和 Nestin 陽性； C. 血清誘導(dǎo) hGSC 分化后 GFAP 染色陽性。1.3.2 血清誘導(dǎo) hGSCs 分化為 hDGCs 后“干性”特點(diǎn)的改變干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下兩株細(xì)胞呈球樣懸浮生長，而經(jīng)過 10% FBS 處理后其可分化為普通 GBM 細(xì)胞，在此過程中其細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯的改變，并且會由懸浮生長狀態(tài)變?yōu)橘N壁生長狀態(tài)（圖 1.3.2A）。為了進(jìn)一步確認(rèn)我們分離的細(xì)胞株具有“干性特點(diǎn)并且可通過胎牛血清誘導(dǎo)分化，我們運(yùn)用分子生物學(xué)方法檢測了分化前后 GSC“性”標(biāo)記物的表達(dá)變化情況。實(shí)時(shí)定量 PCR 結(jié)果顯示，血清誘導(dǎo) hGSCs 分化后，“干性標(biāo)記物 CD133、Vimentin 和 Olig2 的表達(dá)明顯下降（P<0.05）（圖 1.3.2B）。為進(jìn)一步認(rèn)上述結(jié)果，我們使用 WesternBlot從蛋白水平檢測了相關(guān)“干性”標(biāo)記表達(dá)的變化情況與 PCR結(jié)果一致，誘導(dǎo)分化后干性指標(biāo) Nestin、Vimentin 和 Olig2 的表達(dá)出現(xiàn)了明顯

1.3.2 A. 血清誘導(dǎo)分化前后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化情況； B. 誘導(dǎo)指 mRNA標(biāo)表達(dá)變化情況，所有指標(biāo)均明顯下降（P<0.01）；干性指標(biāo)蛋白水平的變化情況。s 誘導(dǎo)分化后血管生成能力改變 GSC 和 DGC 之間血管生成能力的變化，我們分別使用 養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞。CCK-8 結(jié)果顯示，GSC 條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的內(nèi)于 DGC 條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞，兩組差異在第 3 天開.05）（圖 1.3.3A）。使用流式細(xì)胞周期檢測結(jié)果與細(xì)胞增殖 條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖指數(shù)（63%）明顯高于 D%） (P<0.05)（圖 1.3.3B）。隨后我們檢測了兩組之間內(nèi)。條件培養(yǎng)基處理 4 h始可觀察到小管樣結(jié)構(gòu)形成，，同時(shí)小
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R739.4

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