【摘要】：神經(jīng)膠質(zhì)瘤作為最常見(jiàn)的原發(fā)腦腫瘤之一,目前臨床上治療該病的方案包括一期腫瘤切除、烷化劑替莫唑胺化療、放射治療、靶向治療、生物免疫治療等。由于代謝旺盛,神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞微環(huán)境中普遍存在缺氧。缺氧環(huán)境下自由基生成減少,導(dǎo)致放療效果變差。同樣,缺氧狀態(tài)會(huì)抑制腫瘤內(nèi)藥物的攝取、穩(wěn)定和滲透過(guò)程,從而影響化療的效果。因此,缺氧狀態(tài)下神經(jīng)膠質(zhì)瘤的放化療效果不佳。目前用于膠質(zhì)瘤臨床研究的分子靶向藥物較多,如伊馬替尼、吉非替尼、貝伐珠單抗等。但細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路復(fù)雜,不同通路之間存在交互作用,單一靶向藥物治療惡性膠質(zhì)瘤作用有限。有互補(bǔ)作用的不同靶向藥物的聯(lián)合,靶向藥物和細(xì)胞毒類藥物如替莫唑胺,以及放療的聯(lián)合治療或許是提高療效的關(guān)鍵。越來(lái)越多的證據(jù)表明,代謝性谷氨酸受體(metabotropic glutamate receptor,mGluR)可調(diào)節(jié)和維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài),在人類惡性腫瘤中同樣發(fā)揮重要作用。代謝性谷氨酸受體是主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)的G蛋白偶聯(lián)受體,在神經(jīng)元興奮性和突觸可塑性中發(fā)揮重要作用,并調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)釋放的反饋抑制。代謝性谷氨酸受體家族根據(jù)其序列同源性、藥理學(xué)和相關(guān)第二信使信號(hào)通路分為三組。代謝性谷氨酸受體I型(mGluR1和mGluR5)信號(hào)由GTP結(jié)合蛋白(G蛋白)和下游第二信使,如環(huán)磷酸腺苷、二酰甘油和肌醇1,4,5-三磷酸介導(dǎo)。代謝性谷氨酸受體II型和III型信號(hào)通路主要是由Gi/O蛋白介導(dǎo),可釋放Gβγ亞單位來(lái)調(diào)節(jié)腺苷酸環(huán)化酶、離子通道和其他下游信號(hào)分子的活性。本研究第一部分觀察了抑制/激活代謝性谷氨酸受體I型(mGluR 1和mGluR 5)在常氧和缺氧狀態(tài)下對(duì)人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞存活率的影響。本研究第二部分進(jìn)一步明確了缺氧狀態(tài)下抑制代謝性谷氨酸受體5(mGluR5)降低人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞存活率的原因,并進(jìn)一步探索相關(guān)的信號(hào)通路及其對(duì)細(xì)胞存活率和線粒體氧化功能的影響。本研究第三部分為明確代謝性谷氨酸受體5(mGluR5)在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平,收集了部分臨床病例并展開了相關(guān)研究。第一部分抑制代謝性谷氨酸受體5降低缺氧狀態(tài)下神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞存活率目的:觀察抑制/激活代謝性谷氨酸受體I型(mGluR 1和mGluR 5)在常氧和缺氧環(huán)境下對(duì)人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞存活率的影響。方法:常氧和缺氧兩種狀態(tài)下,我們分別用代謝性谷氨酸受體5(mGluR5)特異性抑制劑MPEP(2-甲基-6-苯乙炔基吡啶)、代謝性谷氨酸受體1特異性抑制劑CPCCOEt(7-羥基亞胺環(huán)丙基[b]色氨酸-1a-羧酸乙酯)、代謝性谷氨酸受體I型(mGluR 1和mGluR 5)激動(dòng)劑DHPG(3,5-二羥基苯甘氨酸)及空白對(duì)照對(duì)四種人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系:LNT-229、LNT-308、LNT-428和G55處理24小時(shí),分別使用細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(Roche)的乳酸脫氫酶(LDH)釋放分析,使用碘化丙啶(PI)攝取染色,隨后使用BD Canto II流式細(xì)胞儀評(píng)估缺氧和常氧環(huán)境下各組的細(xì)胞存活率。結(jié)果:常氧狀態(tài)下,MPEP、CPCCEt或DHPG對(duì)四種人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中細(xì)胞存活率沒(méi)有影響。缺氧狀態(tài)下,MPEP處理組乳酸脫氫酶釋放量明顯高于對(duì)照組、CPCCOEt組或DHPG組。常氧狀態(tài)下,MPEP、CPCCOEt或DHPG對(duì)四種人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系細(xì)胞碘化丙啶(PI)染色沒(méi)有影響。在缺氧狀態(tài)下,MPEP處理組比對(duì)照組、CPCCOEt組或DHPG組更能誘導(dǎo)碘化丙啶(PI)染色。小結(jié):缺氧狀態(tài)下,抑制代謝性谷氨酸受體5(mGluR5)降低人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞存活率。第二部分抑制代謝性谷氨酸受體5降低缺氧狀態(tài)下神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞存活率與蛋白激酶B相關(guān)目的:為明確缺氧狀態(tài)下抑制代謝性谷氨酸受體5(mGluR5)降低人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞存活率的原因,我們進(jìn)一步探索相關(guān)的信號(hào)通路及其對(duì)細(xì)胞存活率和線粒體氧化功能的影響。方法:使用比較閾值循環(huán)(2~(-△CT))方法將mRNAs的表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化為對(duì)照組,管家基因琥珀酸脫氫酶復(fù)合亞基A(SDHA)作為負(fù)荷控制,用CFX96實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)(Bio-Rad)和SYBR premix ex Taq II檢測(cè)了在缺氧狀態(tài)下經(jīng)8小時(shí)MPEP、CPCCOEt或空白對(duì)照處理后LNT-229細(xì)胞線粒體氧化功能PGC-1a、PGC-1b、ERR-a、SCO2、ATP5G1、MT-CO1、MT-CYB和MT-CO2。用含磷酸酶和蛋白酶抑制劑混合物的放射免疫沉淀緩沖液裂解了缺氧狀態(tài)下用MPEP、DHPG、CPCCOET或?qū)φ仗幚?小時(shí)后收集的LNT-229細(xì)胞,在十二烷基硫酸鈉(SDS)載藥緩沖液中煮沸溶解物,用SDS-PAGE分離蛋白質(zhì),在室溫下用5%脫脂牛奶和Tween-20在磷酸鹽緩沖液中阻斷1小時(shí)后將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜,用初級(jí)抗體孵育硝酸纖維素膜作為裝載控制,使用Bio-Rad(Hercules,CA,USA)的二級(jí)抗體(1:10000)并使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(Pierce,IL,USA)檢測(cè)抗原-抗體復(fù)合物。在缺氧狀態(tài)下,分別用MPEP、蛋白激酶B激動(dòng)劑(SC79)、MPEP+SC79及空白對(duì)照處理人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系LNT-229細(xì)胞24小時(shí),分別使用細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(Roche)的乳酸脫氫酶(LDH)釋放分析,使用碘化丙啶(PI)攝取染色,隨后使用BD Canto II流式細(xì)胞儀評(píng)估缺氧和常氧環(huán)境下各組的細(xì)胞存活率,同時(shí)按上文所述用RT-PCR方法測(cè)定線粒體氧化功能相關(guān)基因PGC-1a、PGC-1b、ERR-a、SCO2和ATP5G1的含量。結(jié)果:在缺氧狀態(tài)下,與對(duì)照組和CPCCOEt處理組相比,MPEP處理組增加PGC-1a、PGC-1b、ERR-a、SCO2和ATP5G1的含量,而MT-CO1、MT-CYB和MT-CO2的含量未受影響。在缺氧狀態(tài)下的LNT-229細(xì)胞中,MPEP、CPCCOEt或DHPG處理不影響細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶蛋白(ERK)水平和磷酸化率(pERK/ERK),而與對(duì)照組、CPCCOEt或DHPG組比較,MPEP處理顯著降低蛋白激酶B磷酸化(pAkt)水平。在缺氧狀態(tài)下的LNT-229細(xì)胞中,與MPEP組比較,MPEP+SC79組細(xì)胞存活率顯著升高。PGC-1a、PGC-1b、ERR-a、SCO2和ATP5G1含量降低。小結(jié):在缺氧狀態(tài)下抑制代謝性谷氨酸受體5(mGluR5)可增加部分線粒體氧化基因的含量,抑制蛋白激酶B磷酸化。激活蛋白激酶B逆轉(zhuǎn)了這一作用。這說(shuō)明在缺氧狀態(tài)下,抑制代謝性谷氨酸受體5(mGluR5)通過(guò)蛋白激酶B失活提高了線粒體氧化功能,降低了人膠質(zhì)瘤細(xì)胞存活率。第三部分代謝性谷氨酸受體5在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)目的:為了明確代謝性谷氨酸受體5(mGluR5)在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平,我們收集了部分臨床病例并展開了相關(guān)研究。方法:我們收集了河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)外科2018年6月至2018年12月間住院患者27例,術(shù)前均未接受放射治療和化學(xué)治療。所有患者術(shù)后病理均確診膠質(zhì)瘤。我們將每份臨床標(biāo)本分別取出癌組織及癌旁組織(距腫瘤邊緣1cm)進(jìn)行Westem blot檢測(cè),觀察癌組織與癌旁組織中代謝性谷氨酸受體5(mGluR5)的表達(dá)情況。結(jié)果:患者癌組織中代謝性谷氨酸受體5(mGluR5)的表達(dá)高于癌旁組織。我們利用Western blot方法檢測(cè)了代謝性谷氨酸受體5(mGluR5)在患者癌組織和癌旁組織中的表達(dá)情況。與癌旁組織相比,癌組織中代謝性谷氨酸受體5(mGluR5)的表達(dá)增高(P0.05)。小結(jié):人膠質(zhì)瘤細(xì)胞中可檢測(cè)到代謝性谷氨酸受體5(mGluR5),與癌旁組織相比處于高表達(dá)水平,代謝性谷氨酸受體5(mGluR5)可成為人膠質(zhì)瘤臨床治療的潛在靶點(diǎn)。結(jié)論:1.缺氧狀態(tài)下,抑制代謝性谷氨酸受體5(mGluR5)降低人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞存活率。2.在缺氧狀態(tài)下抑制代謝性谷氨酸受體5(mGluR5)可增加部分線粒體氧化基因的含量,抑制蛋白激酶B磷酸化。激活蛋白激酶B逆轉(zhuǎn)了這一作用。這說(shuō)明在缺氧狀態(tài)下,抑制代謝性谷氨酸受體5(mGluR5)通過(guò)蛋白激酶B失活提高了線粒體氧化功能,降低了人膠質(zhì)瘤細(xì)胞存活率。3.人膠質(zhì)瘤細(xì)胞中代謝性谷氨酸受體5(mGluR5)處于高表達(dá)狀態(tài),代謝性谷氨酸受體5(mGluR5)可成為人膠質(zhì)瘤臨床治療的潛在靶點(diǎn)。
【圖文】：

缺氧狀態(tài)下，，MPEP對(duì)代謝性谷氨酸受體5的抑制增加了LDH的釋放（%）

圖 2 缺氧狀態(tài)下，MPEP 對(duì)代謝性谷氨酸受體 5 的抑制增加了碘化丙啶（PI）染色（%）Fig.2 Inhibition of mGluR5 by MPEP selectively increased propidium iodide(PI) staining under hypoxia condition. (A-D) Cell lines LNT-229 (A),LNT-308 (B), LNT-428 (C) and G55 (D) were exposed to normoxia conditionfor 24 hrs. (A′-D′) Cell lines LNT-229 (A′), LNT-308 (B′), LNT-428 (C′) andG55 (D′) were exposed to hypoxia condition (0.1% O2) for 24 hrs. Data showmeans ± SEM. n = 5 experiments per group. Statistical significance wasdetermined by one way ANOVA with Tukey's multiple comparisons test.***P< 0.001
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R739.4

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本文編號(hào)：2617052