【摘要】：神經(jīng)膠質(zhì)瘤作為最常見的原發(fā)腦腫瘤之一,目前臨床上治療該病的方案包括一期腫瘤切除、烷化劑替莫唑胺化療、放射治療、靶向治療、生物免疫治療等。由于代謝旺盛,神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞微環(huán)境中普遍存在缺氧。缺氧環(huán)境下自由基生成減少,導致放療效果變差。同樣,缺氧狀態(tài)會抑制腫瘤內(nèi)藥物的攝取、穩(wěn)定和滲透過程,從而影響化療的效果。因此,缺氧狀態(tài)下神經(jīng)膠質(zhì)瘤的放化療效果不佳。目前用于膠質(zhì)瘤臨床研究的分子靶向藥物較多,如伊馬替尼、吉非替尼、貝伐珠單抗等。但細胞信號傳導通路復雜,不同通路之間存在交互作用,單一靶向藥物治療惡性膠質(zhì)瘤作用有限。有互補作用的不同靶向藥物的聯(lián)合,靶向藥物和細胞毒類藥物如替莫唑胺,以及放療的聯(lián)合治療或許是提高療效的關鍵。越來越多的證據(jù)表明,代謝性谷氨酸受體(metabotropic glutamate receptor,mGluR)可調(diào)節(jié)和維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài),在人類惡性腫瘤中同樣發(fā)揮重要作用。代謝性谷氨酸受體是主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達的G蛋白偶聯(lián)受體,在神經(jīng)元興奮性和突觸可塑性中發(fā)揮重要作用,并調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)釋放的反饋抑制。代謝性谷氨酸受體家族根據(jù)其序列同源性、藥理學和相關第二信使信號通路分為三組。代謝性谷氨酸受體I型(mGluR1和mGluR5)信號由GTP結(jié)合蛋白(G蛋白)和下游第二信使,如環(huán)磷酸腺苷、二酰甘油和肌醇1,4,5-三磷酸介導。代謝性谷氨酸受體II型和III型信號通路主要是由Gi/O蛋白介導,可釋放Gβγ亞單位來調(diào)節(jié)腺苷酸環(huán)化酶、離子通道和其他下游信號分子的活性。本研究第一部分觀察了抑制/激活代謝性谷氨酸受體I型(mGluR 1和mGluR 5)在常氧和缺氧狀態(tài)下對人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞存活率的影響。本研究第二部分進一步明確了缺氧狀態(tài)下抑制代謝性谷氨酸受體5(mGluR5)降低人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞存活率的原因,并進一步探索相關的信號通路及其對細胞存活率和線粒體氧化功能的影響。本研究第三部分為明確代謝性谷氨酸受體5(mGluR5)在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中的表達水平,收集了部分臨床病例并展開了相關研究。第一部分抑制代謝性谷氨酸受體5降低缺氧狀態(tài)下神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞存活率目的:觀察抑制/激活代謝性谷氨酸受體I型(mGluR 1和mGluR 5)在常氧和缺氧環(huán)境下對人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞存活率的影響。方法:常氧和缺氧兩種狀態(tài)下,我們分別用代謝性谷氨酸受體5(mGluR5)特異性抑制劑MPEP(2-甲基-6-苯乙炔基吡啶)、代謝性谷氨酸受體1特異性抑制劑CPCCOEt(7-羥基亞胺環(huán)丙基[b]色氨酸-1a-羧酸乙酯)、代謝性谷氨酸受體I型(mGluR 1和mGluR 5)激動劑DHPG(3,5-二羥基苯甘氨酸)及空白對照對四種人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系:LNT-229、LNT-308、LNT-428和G55處理24小時,分別使用細胞毒性檢測試劑盒(Roche)的乳酸脫氫酶(LDH)釋放分析,使用碘化丙啶(PI)攝取染色,隨后使用BD Canto II流式細胞儀評估缺氧和常氧環(huán)境下各組的細胞存活率。結(jié)果:常氧狀態(tài)下,MPEP、CPCCEt或DHPG對四種人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系中細胞存活率沒有影響。缺氧狀態(tài)下,MPEP處理組乳酸脫氫酶釋放量明顯高于對照組、CPCCOEt組或DHPG組。常氧狀態(tài)下,MPEP、CPCCOEt或DHPG對四種人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系細胞碘化丙啶(PI)染色沒有影響。在缺氧狀態(tài)下,MPEP處理組比對照組、CPCCOEt組或DHPG組更能誘導碘化丙啶(PI)染色。小結(jié):缺氧狀態(tài)下,抑制代謝性谷氨酸受體5(mGluR5)降低人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞存活率。第二部分抑制代謝性谷氨酸受體5降低缺氧狀態(tài)下神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞存活率與蛋白激酶B相關目的:為明確缺氧狀態(tài)下抑制代謝性谷氨酸受體5(mGluR5)降低人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞存活率的原因,我們進一步探索相關的信號通路及其對細胞存活率和線粒體氧化功能的影響。方法:使用比較閾值循環(huán)(2~(-△CT))方法將mRNAs的表達標準化為對照組,管家基因琥珀酸脫氫酶復合亞基A(SDHA)作為負荷控制,用CFX96實時PCR檢測系統(tǒng)(Bio-Rad)和SYBR premix ex Taq II檢測了在缺氧狀態(tài)下經(jīng)8小時MPEP、CPCCOEt或空白對照處理后LNT-229細胞線粒體氧化功能PGC-1a、PGC-1b、ERR-a、SCO2、ATP5G1、MT-CO1、MT-CYB和MT-CO2。用含磷酸酶和蛋白酶抑制劑混合物的放射免疫沉淀緩沖液裂解了缺氧狀態(tài)下用MPEP、DHPG、CPCCOET或?qū)φ仗幚?小時后收集的LNT-229細胞,在十二烷基硫酸鈉(SDS)載藥緩沖液中煮沸溶解物,用SDS-PAGE分離蛋白質(zhì),在室溫下用5%脫脂牛奶和Tween-20在磷酸鹽緩沖液中阻斷1小時后將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜,用初級抗體孵育硝酸纖維素膜作為裝載控制,使用Bio-Rad(Hercules,CA,USA)的二級抗體(1:10000)并使用增強化學發(fā)光(Pierce,IL,USA)檢測抗原-抗體復合物。在缺氧狀態(tài)下,分別用MPEP、蛋白激酶B激動劑(SC79)、MPEP+SC79及空白對照處理人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系LNT-229細胞24小時,分別使用細胞毒性檢測試劑盒(Roche)的乳酸脫氫酶(LDH)釋放分析,使用碘化丙啶(PI)攝取染色,隨后使用BD Canto II流式細胞儀評估缺氧和常氧環(huán)境下各組的細胞存活率,同時按上文所述用RT-PCR方法測定線粒體氧化功能相關基因PGC-1a、PGC-1b、ERR-a、SCO2和ATP5G1的含量。結(jié)果:在缺氧狀態(tài)下,與對照組和CPCCOEt處理組相比,MPEP處理組增加PGC-1a、PGC-1b、ERR-a、SCO2和ATP5G1的含量,而MT-CO1、MT-CYB和MT-CO2的含量未受影響。在缺氧狀態(tài)下的LNT-229細胞中,MPEP、CPCCOEt或DHPG處理不影響細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶蛋白(ERK)水平和磷酸化率(pERK/ERK),而與對照組、CPCCOEt或DHPG組比較,MPEP處理顯著降低蛋白激酶B磷酸化(pAkt)水平。在缺氧狀態(tài)下的LNT-229細胞中,與MPEP組比較,MPEP+SC79組細胞存活率顯著升高。PGC-1a、PGC-1b、ERR-a、SCO2和ATP5G1含量降低。小結(jié):在缺氧狀態(tài)下抑制代謝性谷氨酸受體5(mGluR5)可增加部分線粒體氧化基因的含量,抑制蛋白激酶B磷酸化。激活蛋白激酶B逆轉(zhuǎn)了這一作用。這說明在缺氧狀態(tài)下,抑制代謝性谷氨酸受體5(mGluR5)通過蛋白激酶B失活提高了線粒體氧化功能,降低了人膠質(zhì)瘤細胞存活率。第三部分代謝性谷氨酸受體5在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中的表達目的:為了明確代謝性谷氨酸受體5(mGluR5)在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中的表達水平,我們收集了部分臨床病例并展開了相關研究。方法:我們收集了河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院神經(jīng)外科2018年6月至2018年12月間住院患者27例,術前均未接受放射治療和化學治療。所有患者術后病理均確診膠質(zhì)瘤。我們將每份臨床標本分別取出癌組織及癌旁組織(距腫瘤邊緣1cm)進行Westem blot檢測,觀察癌組織與癌旁組織中代謝性谷氨酸受體5(mGluR5)的表達情況。結(jié)果:患者癌組織中代謝性谷氨酸受體5(mGluR5)的表達高于癌旁組織。我們利用Western blot方法檢測了代謝性谷氨酸受體5(mGluR5)在患者癌組織和癌旁組織中的表達情況。與癌旁組織相比,癌組織中代謝性谷氨酸受體5(mGluR5)的表達增高(P0.05)。小結(jié):人膠質(zhì)瘤細胞中可檢測到代謝性谷氨酸受體5(mGluR5),與癌旁組織相比處于高表達水平,代謝性谷氨酸受體5(mGluR5)可成為人膠質(zhì)瘤臨床治療的潛在靶點。結(jié)論:1.缺氧狀態(tài)下,抑制代謝性谷氨酸受體5(mGluR5)降低人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞存活率。2.在缺氧狀態(tài)下抑制代謝性谷氨酸受體5(mGluR5)可增加部分線粒體氧化基因的含量,抑制蛋白激酶B磷酸化。激活蛋白激酶B逆轉(zhuǎn)了這一作用。這說明在缺氧狀態(tài)下,抑制代謝性谷氨酸受體5(mGluR5)通過蛋白激酶B失活提高了線粒體氧化功能,降低了人膠質(zhì)瘤細胞存活率。3.人膠質(zhì)瘤細胞中代謝性谷氨酸受體5(mGluR5)處于高表達狀態(tài),代謝性谷氨酸受體5(mGluR5)可成為人膠質(zhì)瘤臨床治療的潛在靶點。
【圖文】：

缺氧狀態(tài)下，，MPEP對代謝性谷氨酸受體5的抑制增加了LDH的釋放（%）

圖 2 缺氧狀態(tài)下，MPEP 對代謝性谷氨酸受體 5 的抑制增加了碘化丙啶（PI）染色（%）Fig.2 Inhibition of mGluR5 by MPEP selectively increased propidium iodide(PI) staining under hypoxia condition. (A-D) Cell lines LNT-229 (A),LNT-308 (B), LNT-428 (C) and G55 (D) were exposed to normoxia conditionfor 24 hrs. (A′-D′) Cell lines LNT-229 (A′), LNT-308 (B′), LNT-428 (C′) andG55 (D′) were exposed to hypoxia condition (0.1% O2) for 24 hrs. Data showmeans ± SEM. n = 5 experiments per group. Statistical significance wasdetermined by one way ANOVA with Tukey's multiple comparisons test.***P< 0.001
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R739.4

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本文編號：2617052