【摘要】：膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中常見的惡性腫瘤,同時也是惡性程度最高的腫瘤之一,其發(fā)病率可達(dá)3～5/10萬。中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)(世界衛(wèi)生組織2007年)將膠質(zhì)瘤分為四種病理亞型(WHOI-Ⅳ級)。由于WHO Ⅳ級膠質(zhì)母細(xì)胞瘤生長速度快,患者癥狀較重,而且往往短期內(nèi)復(fù)發(fā),預(yù)后多不良。目前臨床醫(yī)生即使采用手術(shù)為主,放化療為輔助的綜合治療,膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的中位生存期也僅有12～14個月。近年來,研究人員對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了大量研究,但是對其確切的發(fā)病機(jī)制并未揭示。得益于分子生物學(xué)的發(fā)展,分子靶向治療有可能為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者帶來新希望。因此,尋找與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤發(fā)生和惡性進(jìn)展的相關(guān)的分子迫在眉睫。正常細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化常伴隨著細(xì)胞能量代謝的重塑,這種代謝重塑被稱為Warburg效應(yīng),即腫瘤細(xì)胞主要通過糖酵解提供能量,即使在供氧充足的情況下也是如此。相比于線粒體介導(dǎo)的有氧呼吸,糖酵解雖然產(chǎn)能效率較低,但是可以為細(xì)胞組分的合成提供必要的大分子原料,并可重塑細(xì)胞生長的微環(huán)境,增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞凋亡耐受和侵襲能力,是腫瘤抵抗治療及復(fù)發(fā)的關(guān)鍵機(jī)制。研究表明,Warburg效應(yīng)在多種腫瘤中廣泛存在,膠質(zhì)母細(xì)胞瘤也不例外。但是到目前為止,Warburg效應(yīng)具體的分子機(jī)制仍不十分明確。Polycomb group(PcG)蛋白作為一組非常重要的轉(zhuǎn)錄因子,在細(xì)胞多種生物學(xué)功能中發(fā)揮著重要作用。PcG蛋白組分雖然在結(jié)構(gòu)上并不相似,但是其功能保持一致性,通過對組蛋白的表觀遺傳學(xué)修飾,對下游靶基因起到轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用,因此其被劃分為同一個家族。PcG蛋白最初在果蠅中被發(fā)現(xiàn),隨著研究的深入,人們發(fā)現(xiàn)其存在于包括人類在內(nèi)的多個物種,而且序列高度保守。PcG蛋白通常通過構(gòu)成兩種蛋白復(fù)合體發(fā)揮作用,多梳蛋白抑制復(fù)合體1(Polycomb expressive complex1,PRC1)和多梳蛋白抑制復(fù)合體2(Polycomb expressive complex2,PRC2)。EZH2 蛋白是 PRC2 中重要的催化亞基,其可以通過調(diào)控組蛋白H3K27的甲基化水平來實(shí)現(xiàn)對靶基因的轉(zhuǎn)錄抑制。EZH2通常在胚胎時期表達(dá)水平較高,待細(xì)胞分化成熟后表達(dá)降低。目前的研究表明EZH2在多種腫瘤中表達(dá)顯著上調(diào),包括乳腺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、宮頸癌和肺癌,以及肉瘤和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等。并且,EZH2與這些腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后密切相關(guān)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)的EZH2靶基因?qū)儆谀[瘤抑制基因,如對于腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲有重要意義的 INK4B-ARF-INK4A,p57,BMPR1B,MyoD 和 RUNX3 等。與腫瘤侵襲、遷移有關(guān)的CHD1基因以及與腫瘤血管發(fā)生相關(guān)的Bim,TRAIL,FB032三種分子均可受到EZH2的調(diào)控抑制。早在2009年,Liu等首次發(fā)現(xiàn)作為PRC1重要組分的Bmi1蛋白在線粒體代謝中發(fā)揮著重要作用,但是作為PRC2核心組分的EZH2是否參與并影響腫瘤細(xì)胞能量代謝的重塑機(jī)制目前尚未見報道。HMGA1是另一重要蛋白家族,高遷移率蛋白(High mobility group proteins,HMGs)的成員之一,目前研究較為廣泛。HMGA1能夠結(jié)合DNA的AT序列富集區(qū),通過蛋白-蛋白和蛋白-DNA相互作用改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu),進(jìn)而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄過程。同時,HMGA1能與許多轉(zhuǎn)錄因子相互作用并且調(diào)節(jié)其活性,包括 NF-κB,ATF-2/c-Jun,Elf-1,Oct-2,Oct-6,SRF 和 NF-Y 等。和 EZH2類似,HMGA1在胚胎發(fā)育的過程中高表達(dá),在成人分化成熟的細(xì)胞中表達(dá)量下降,而在多種惡性腫瘤中其表達(dá)顯著上調(diào)。已有研究證實(shí),HMGA1在包括胰腺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌和膠質(zhì)瘤等多種惡性腫瘤中高表達(dá)。如在胰腺導(dǎo)管腺癌中,HMGA1的高表達(dá)預(yù)示著腫瘤惡性程度高,患者生存期短。我們先前的研究也表明,HMGA1在不同級別的膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平不同,其表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤的病理級別、增殖、轉(zhuǎn)移、血管生成能力成正相關(guān),但是作為一種高復(fù)發(fā)性腫瘤,HMGA1在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤復(fù)發(fā)中的作用及機(jī)制尚不明確。本課題分為兩部分,第一部分研究EZH2對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤能量代謝的影響和具體機(jī)制,第二部分初步探究了 HMGA1與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤復(fù)發(fā)和預(yù)后的關(guān)系。第一部分:EZH2對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤能量代謝的影響及機(jī)制研究一、EZH2在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤糖酵解過程中的作用我們將 SC-shRNA,EZH2-shRNA,pJAX-SC,pJAX-EZH2 分別轉(zhuǎn)染進(jìn)U251和T98G細(xì)胞構(gòu)建EZH2敲除和過表達(dá)的細(xì)胞模型。脫氧葡萄糖檢測結(jié)果表明,當(dāng)細(xì)胞中的EZH2表達(dá)升高時,細(xì)胞的脫氧葡萄糖攝取量明顯升高,EZH2表達(dá)降低后則會呈現(xiàn)相反的結(jié)果。qRT-PCR、酶活性檢測和乳酸生成檢測結(jié)果顯示,U251和T98G細(xì)胞過表達(dá)EZH2后,細(xì)胞中有關(guān)糖酵解的三種酶類:HK2、PKM2、PFK1表達(dá)及活性都得以增高,同時乳酸的分泌量增加。以上結(jié)果表明,在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中過表達(dá)EZH2可以提高細(xì)胞糖酵解代謝水平。我們進(jìn)一步通過美國海馬細(xì)胞能量代謝實(shí)時測定儀檢測EZH2敲除的U251和T98G細(xì)胞耗氧率(OCR)的變化,并先后加入寡霉素和FCCP解偶聯(lián)劑,結(jié)果顯示,腫瘤細(xì)胞自身的氧耗量呈現(xiàn)出先降低后升高的趨勢。EZH2敲除后,膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞氧耗率和耗氧能力的儲備值都顯著降低,而EZH2的過表達(dá)則對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞OCR影響不大。另一方面,細(xì)胞能量代謝實(shí)時測定儀對膠質(zhì)瘤細(xì)胞細(xì)胞外酸化率(ECAR)的檢測結(jié)果表明,EZH2的表達(dá)增高可以提高細(xì)胞ECAR,在先后加入寡霉素和FCCP解偶聯(lián)劑后,腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞外酸化率首先出現(xiàn)小幅度降低,然后大幅回升。接著我們通過MTT方法連續(xù)檢測含糖或無糖條件下EZH2對膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長的影響,結(jié)果顯示,在含糖條件培養(yǎng)下,EZH2的表達(dá)增高可以使腫瘤細(xì)胞增殖活性明顯升高,而無糖條件培養(yǎng)下,高表達(dá)EZH2的腫瘤細(xì)胞增長速度明顯慢于對照組細(xì)胞。這些結(jié)果表明,EZH2可以促使膠質(zhì)母細(xì)胞瘤代謝從線粒體有氧呼吸向糖酵解轉(zhuǎn)變。接下來我們構(gòu)建轉(zhuǎn)染 pJAX-SC,pJAX-EZH2,pJAX-EZH2+HIF1α-shRNA的三種U251細(xì)胞系,并通過顯微定位技術(shù)將三種細(xì)胞系分別注射進(jìn)三組隨機(jī)分配的裸鼠腦中。培養(yǎng)32天后,通過HE染色技術(shù)處理三組載瘤裸鼠腦組織,并測量種植瘤體積。繼續(xù)飼養(yǎng)剩余小鼠直至死亡,同時統(tǒng)計剩余小鼠各個時期的存活數(shù)量,繪制三組小鼠的生存曲線。實(shí)驗結(jié)果顯示,EZH2表達(dá)增高可以使腫瘤體積增大,同時明顯縮短載瘤裸鼠的生存期。如果同時抑制代謝關(guān)鍵分子HIF1α的表達(dá),可以一定程度上縮小腫瘤體積,并且延長載瘤裸鼠的生存期。利用qRT-PCR檢測裸鼠顱內(nèi)腫瘤中三種糖酵解酶HK2,PKM2和PFK1的表達(dá),顯示EZH2表達(dá)升高可以使腫瘤細(xì)胞中三種酶的表達(dá)顯著增高。我們通過液相色譜-質(zhì)譜法來檢測不同EZH2表達(dá)水平裸鼠膠質(zhì)瘤中代謝相關(guān)產(chǎn)物的變化,發(fā)現(xiàn)EZH2高表達(dá)的腫瘤組織中糖酵解中間產(chǎn)物比對照組明顯增高,而三羧酸循環(huán)過程中的產(chǎn)物卻沒有顯著變化。這些結(jié)果證實(shí)EZH2與顱內(nèi)異種移植膠質(zhì)瘤的代謝重塑相關(guān)。二、EZH2如何通過EAF2-HIF1α信號途徑來影響糖酵解過程進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生和惡變?nèi)毖跽T導(dǎo)因子(HIF-1)是機(jī)體在缺氧環(huán)境中生成的一種具有調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的缺氧應(yīng)答因子,有研究表明,HIF-1α參與了低氧環(huán)境中膠質(zhì)瘤的進(jìn)展過程。通過熒光素酶報告基因方法檢測U251和T98G細(xì)胞中EZH2對于HIF1α轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控作用。我們將下列三種成分共轉(zhuǎn)染到U251和T98G兩種細(xì)胞中:pGL2-HIF1α;EZH2-shRNA 或者 SC-shRNA 或者 pJAX-SC 或者pJAX-EZH2;內(nèi)參pSV-Renilla,通過熒光測定儀測定熒光素酶氧化過程中釋放的生物熒光。通過與內(nèi)參熒光強(qiáng)度進(jìn)行對比,顯示細(xì)胞中EZH2表達(dá)增高后,HIFlα的轉(zhuǎn)錄活性升高,而當(dāng)敲除EZH2后,HIF1α的轉(zhuǎn)錄活性降低。同時,Western Blot檢測結(jié)果表明,U251和T98G中過表達(dá)EZH2,HIF1α蛋白水平升高。接下來我們將不同EZH2表達(dá)水平的U251細(xì)胞進(jìn)行核漿分離,Western Blot結(jié)果顯示,EZH2高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞胞核中HIF1α蛋白表達(dá)明顯升高。免疫組織化學(xué)技術(shù)和Western Blot對不同EZH2表達(dá)水平的裸鼠顱內(nèi)膠質(zhì)瘤中HIF1α含量檢測結(jié)果顯示,EZH2高表達(dá)的腫瘤組織中HIF1α含量也相應(yīng)升高。我們將低表達(dá)或正常表達(dá)HIF1α的U251和T98G細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染pJAX-SC或pJAX-EZH2,然后分別檢測不同組細(xì)胞糖酵解酶HK2,PKM2和PFK1活性,以及脫氧葡萄糖的攝取和乳酸的產(chǎn)量,結(jié)果顯示,膠質(zhì)瘤細(xì)胞HIF1α表達(dá)被沉默之后,無論是否正常表達(dá)EZH2,細(xì)胞的糖酵解酶(HK2、PKM2、PFK1)活性以及脫氧葡萄糖攝取量、乳酸生成量都受到抑制。這些實(shí)驗結(jié)果證明,EZH2通過HIF1α來介導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的代謝重塑。我們前期預(yù)實(shí)驗CHIP發(fā)現(xiàn)EZH2介導(dǎo)的H3K27并不能和HIF的啟動子區(qū)域結(jié)合,而有研究顯示,EAF2可以與腫瘤抑制蛋白pVHL相結(jié)合,從而中斷了 HIF-1α介導(dǎo)的缺氧信號通路。我們通過免疫組織化學(xué)方法檢測了 105例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤標(biāo)本及12例正常腦組織標(biāo)本中EZH2和EAF2表達(dá)含量。然后運(yùn)用線性回歸分析的方法得出EZH2和EAF2含量的關(guān)系,我們發(fā)現(xiàn)有77%的膠質(zhì)瘤標(biāo)本中EZH2呈現(xiàn)高表達(dá),而EAF2在69%的膠質(zhì)瘤標(biāo)本中表達(dá)降低。根據(jù)線性回歸分析可以得出,兩者的表達(dá)成顯著負(fù)相關(guān)。我們將U251和T98G細(xì)胞均分別轉(zhuǎn)染EZH2-shRNA和pJAX-EZH2,通過Western B1ot方法檢測HIF1α和EAF2表達(dá)水平,緊接著我們將膠質(zhì)瘤細(xì)胞共轉(zhuǎn)染EZH2-shRNA和EAF2-shRNA,然后檢測HIF1α的表達(dá)水平。結(jié)果過表達(dá)EZH2既可以使膠質(zhì)瘤細(xì)胞HIF1α表達(dá)升高,也可以抑制EAF2的表達(dá),而當(dāng)EZH2表達(dá)被沉默后則得出相反的結(jié)果。當(dāng)細(xì)胞共同轉(zhuǎn)染EZH2和EAF2的shRNA后,HIF1α的表達(dá)水平可以因EAF2抑制而出現(xiàn)部分逆轉(zhuǎn)。同時,利用Western Blot檢測了 EZH2在過表達(dá)時兩種甲基化轉(zhuǎn)移酶H3K27me3、H3K9me3在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平,結(jié)果顯示,隨著細(xì)胞中EZH2表達(dá)的升高,H3K27me3含量也明顯增加,而H3K9me3含量卻無明顯變化。最后,通過免疫共沉淀技術(shù)來了解EZH2和H3K27me3與EAF2啟動子區(qū)域的相互作用。實(shí)驗結(jié)果顯示,EZH2可以直接與EAF2啟動子相結(jié)合,H3K27me3表觀遺傳學(xué)標(biāo)志存在于EAF2基因組位點(diǎn)上。本研究表明,EZH2可以促使膠質(zhì)母細(xì)胞從有氧呼吸向糖酵解代謝途徑轉(zhuǎn)變,從而極大的提高細(xì)胞糖酵解代謝水平。其具體機(jī)制是部分是通過EAF2-HIF1α信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活腫瘤糖酵解過程進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和惡變。第二部分:HMGA1與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤復(fù)發(fā)及預(yù)后的關(guān)系研究納入研究的25名患者原發(fā)和復(fù)發(fā)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤,經(jīng)兩名病理學(xué)專家重新評估,診斷準(zhǔn)確有效,年齡和性別的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。平均無進(jìn)展生存期為9.8個月。通過免疫組化的方法對原發(fā)和復(fù)發(fā)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤標(biāo)本中的HMGA1的表達(dá)水平檢測顯示,復(fù)發(fā)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤標(biāo)本中的HMGA1的表達(dá)水平高于原發(fā)組。復(fù)發(fā)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中輔助治療手段和HMGA1表達(dá)水平之間無顯著相關(guān)性。通過免疫組化對IDH-1R132H位點(diǎn)突變情況進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)原發(fā)組中,HMGA1表達(dá)和IDH-1R132H位點(diǎn)突變之間未見顯著相關(guān)性。統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn),高表達(dá)HMGA1的原發(fā)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的中位無進(jìn)展生存期低于低表達(dá)(未表達(dá))組;IDH-1R132H位點(diǎn)突變患者與無IDH-1R132H位點(diǎn)突變患者的無進(jìn)展生存期未見顯著差異;腫瘤部分切除患者和腫瘤肉眼全切患者的無進(jìn)展生存期無顯著差異。本研究發(fā)現(xiàn),復(fù)發(fā)的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤比起原發(fā)腫瘤HMGA1表達(dá)水平更高。HMGA1的表達(dá)水平越高,患者無進(jìn)展生存期越短。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R739.4

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Yuan-Yuan Xu;Pei Gao;Ying Sun;You-Rong Duan;;Development of targeted therapies in treatment of glioblastoma[J];Cancer Biology & Medicine;2015年03期

本文編號：2616942