【摘要】：背景蛛網(wǎng)膜下腔出血(Subarachnoid Hemorrhage,SAH)是腦或脊髓血管突然破裂和進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔的血液所致的一種急性腦血管病,至今臨床上仍無有效治療方法。SAH分為72h內(nèi)的早期腦損傷(Early Brain Injury,EBI)和之后的遲發(fā)型腦血管痙攣(Delayed Cerebral Vasospasm,DCVS)兩個(gè)病理階段,EBI主導(dǎo)SAH預(yù)后。近年來針對(duì)SAH后EBI期自噬的研究多認(rèn)為線粒體功能受損和自噬異常活躍導(dǎo)致神經(jīng)元死亡,但其具體機(jī)制仍未闡明。SAH后活化的p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)不僅參與腦血管痙攣(Cerebral Vasospasm,CVS)發(fā)生發(fā)展,還可通過調(diào)節(jié)自噬和線粒體功能參與EBI。SB203580屬于吡啶異咪噠唑類p38抑制劑,通過直接作用于p38本身,選擇性地抑制p38磷酸化。本研究利用具有交感神經(jīng)元特性的PC12細(xì)胞和SD大鼠建立SAH模型,通過觀察p38抑制劑對(duì)SAH后DJ-1蛋白、自噬相關(guān)蛋白(Atg5、LC3-II、LC3-I和p62)、線粒體功能和神經(jīng)功能的影響,從調(diào)控自噬和線粒體功能的角度探討其對(duì)神經(jīng)元的作用及機(jī)制。目的探討p38抑制劑調(diào)控DJ-1對(duì)SAH后神經(jīng)功能的保護(hù)作用及機(jī)制。方法1.利用PC12細(xì)胞建立SAH模型,MTT(噻唑藍(lán))法篩選氧合血紅蛋白(Oxyhemoglobin,Oxy Hb)對(duì)PC12細(xì)胞的最佳作用時(shí)間和p38抑制劑對(duì)PC12細(xì)胞的最佳保護(hù)濃度。2.PC12細(xì)胞隨機(jī)分為四組:sham組、SAH組、SAH+DMSO組及p38抑制劑組,用熒光探針JC-1檢測各組線粒體膜電位變化。3.視交叉前池注血法制作大鼠SAH模型,24只成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為四組:sham組、SAH組、SAH+DMSO組及p38抑制劑組。Western blot檢測各組p38、p-p38、DJ-1、Atg5、p62、LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ表達(dá)變化。4.Garcia神經(jīng)功能評(píng)分表評(píng)估大鼠神經(jīng)功能。結(jié)果1.OxyHb對(duì)PC12細(xì)胞生長活力的影響呈時(shí)間依賴性:OxyHb刺激細(xì)胞生長12h時(shí),細(xì)胞活力雖有顯著升高,但較24h和48h相比仍處在較低水平(P0.01),24h和48h時(shí)細(xì)胞活力相差不大(P0.05)。SAH后24h和48h細(xì)胞活力均明顯升高(P0.01 vs sham組);SB203580對(duì)PC12細(xì)胞活力的影響呈濃度依賴性:與SAH組相比,1μM的SB203580處理24 h細(xì)胞活力降低(P0.05),48h無差異(P0.05);同樣,10μM的SB203580處理24 h細(xì)胞活力也降低(P0.05),48h無差異(P0.05);但是,當(dāng)SB203580濃度達(dá)到20μM時(shí),處理24h和48h的細(xì)胞活力均顯著低于SAH組(P0.01,P0.05),接近正常水平(P0.05 vs sham組)。2.P38抑制劑通過抑制p38活性保護(hù)SAH后線粒體膜電位。與sham組相比,SAH后線粒體膜電位降低(P0.01),SAH+DMSO組線粒體膜電位進(jìn)一步降低(P0.01),但p38抑制劑處理后線粒體膜電位明顯升高(P0.01 vs SAH組),接近正常水平(P0.05 vs sham組)。3.p38抑制劑抑制p-p38的表達(dá):與sham組相比,p38在SAH組、SAH+DMSO組及p38抑制組中的表達(dá)逐漸增加(P0.01);p-p38在SAH組和SAH+DMSO組中表達(dá)逐漸上調(diào)(P0.01 vs sham組),但p38抑制劑處理后基本恢復(fù)到正常水平(P=0.136 vs sham組,P0.01 vs SAH組,P0.01 vs SAH+DMSO組)。p38抑制劑上調(diào)DJ-1的表達(dá):DJ-1在sham組中表達(dá)量非常低,SAH后表達(dá)升高(P0.01vs sham組),SAH+DMSO組DJ-1的表達(dá)繼續(xù)增加(P0.01 vs sham組,P0.01 vs SAH組),p38抑制劑處理后其表達(dá)量激增(P0.01 vs sham組,P0.01 vs SAH組,P0.01 vs SAH+DMSO組)。p38抑制劑上調(diào)自噬水平,抑制異常自噬:與sham組相比,SAH組和SAH+DMSO組Atg5及LC3-II/LC3-I水平逐漸升高(P0.01),p38抑制劑處理后,Atg5和LC3-II/LC3-I水平恢復(fù)至SAH組和DMSO組之間(P0.01 vs sham組,P0.01 vs SAH組,P0.01 vs SAH+DMSO組);p62表達(dá)在SAH后下降(P0.01 vs sham組);SAH+DMSO組p62表達(dá)上調(diào)至sham水平(P=0.129vs sham組,P0.01 vs SAH組),但p38抑制劑處理后p62的表達(dá)恢復(fù)至SAH水平,(P0.01 vs sham組,P=0.650 vs SAH組,P0.01 vs SAH+DMSO組)。4.p38抑制劑保護(hù)大鼠SAH后神經(jīng)功能:SAH后Garcia神經(jīng)功能評(píng)分降低(P0.01 vs sham組),p38抑制劑處理后神經(jīng)功能雖然未能達(dá)到sham組水平,但較SAH組卻顯著升高(P0.01),與sham組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.063)。結(jié)論在SAH后EBI階段p38抑制劑下調(diào)p-p38活性后通過上調(diào)DJ-1表達(dá)、抑制異常自噬、維持線粒體功能而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。
【圖文】：

BMTT法檢測OxyHb不同作用時(shí)間的PC12細(xì)胞活性注：**表示與sham組比較P＜0.01

顯微鏡下觀察PC12細(xì)胞（×200）
【學(xué)位授予單位】：新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R743.35

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2616513