【摘要】：第一部分:電刺激清醒小鼠上矢狀竇區(qū)硬腦膜模擬偏頭痛相關(guān)行為學(xué)研究目的:偏頭痛動(dòng)物模型的建立可以幫助我們探究偏頭痛的發(fā)生機(jī)制,尋找潛在的治療靶點(diǎn),目前為止,尚沒(méi)有任何一種動(dòng)物模型可以模擬出偏頭痛發(fā)生的整個(gè)階段。臨床上偏頭痛患者不僅具有頭痛還伴有畏光、不愿活動(dòng)等特征,本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)電刺激清醒小鼠上矢狀竇區(qū)硬腦膜建立一種小鼠頭痛模型,并驗(yàn)證其具有偏頭痛樣的相關(guān)行為。方法:C57小鼠通過(guò)手術(shù)暴露上矢狀竇區(qū)硬腦膜,并安置電極,預(yù)實(shí)驗(yàn)給予不同強(qiáng)度電刺激,通過(guò)觀察小鼠行為學(xué)表現(xiàn)確定最適強(qiáng)度,同時(shí)在麻醉狀態(tài)下通過(guò)激光散斑血流成像儀驗(yàn)證該強(qiáng)度是否會(huì)引發(fā)既往文獻(xiàn)報(bào)道的硬腦膜血流改變。最后通過(guò)手術(shù)建立69只C57小鼠模型,隨機(jī)將其分為3組,分別為:組1為假刺激+生理鹽水組(n=23);組2為電刺激+生理鹽水組(n=23),組3為電刺激+舒馬曲普坦組(n=23)。對(duì)這三組小鼠進(jìn)行疼痛行為觀察、畏光實(shí)驗(yàn)、以及水迷宮運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn),從而驗(yàn)證該三組小鼠是否具有偏頭痛樣的行為學(xué)表現(xiàn)。結(jié)果:通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定電刺激小鼠的強(qiáng)度為0.5mA/2Hz,麻醉狀態(tài)下該強(qiáng)度可以模擬出既往報(bào)道的血流變化。相比組1,組2給予電刺激后,小鼠表現(xiàn)出用后爪或者前爪搔抓頭皮和眼眶皮膚的時(shí)間明顯增長(zhǎng),在畏光實(shí)驗(yàn)中在光亮部分停留時(shí)間變短,在黑暗及光亮之間穿梭次數(shù)減少,以及在運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)距離減少,組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。當(dāng)組3提前給予舒馬曲普坦腹腔注射后,可以不同程度的抑制上述行為學(xué)的變化。結(jié)論:電刺激清醒小鼠上矢狀竇區(qū)硬腦膜可以模擬出類似于偏頭痛樣的行為學(xué)表現(xiàn),為將來(lái)藥物研究的行為觀察提供更多參考指標(biāo)。第二部分:重復(fù)電刺激清醒小鼠上矢狀竇區(qū)硬腦膜時(shí)痛覺(jué)敏化形成特點(diǎn)及機(jī)制目的:慢性偏頭痛給患者帶來(lái)極大的疾病負(fù)擔(dān),目前制約慢性偏頭痛新的治療手段發(fā)展的重要瓶頸之一就是缺乏有效的預(yù)測(cè)性動(dòng)物模型。痛覺(jué)敏化作為偏頭痛的一項(xiàng)特征樣表現(xiàn),目前具體機(jī)制尚不清楚,本研究旨在通過(guò)重復(fù)電刺激清醒小鼠上矢狀竇區(qū)硬腦膜構(gòu)建慢性偏頭痛模型,并初步探索偏頭痛痛覺(jué)敏化特點(diǎn)及機(jī)制。方法:將24只造模后小鼠隨機(jī)分為三組,組1:假刺激+生理鹽水組;組2:電刺激+生理鹽水組;組3:電刺激+舒馬曲普坦組。Vonfery纖維絲測(cè)量電刺激/假刺激后小鼠足底的機(jī)械痛閾變化,并麻醉灌注取腦進(jìn)行TNC區(qū)以及高頸段的Fos蛋白染色。再將32只小鼠隨機(jī)分為4組:組1:假刺激+生理鹽水組;組2:電刺激+生理鹽水組;組3:電刺激+舒馬曲普坦組;組4:電刺激+托吡酯組,術(shù)后恢復(fù)一周后,每天分別給予四組腹腔注射生理鹽水、舒馬曲普坦或托吡酯,分別在1、3、5、7、9天給予電刺激或假刺激,刺激前測(cè)量小鼠后爪機(jī)械痛閾,分別于第1天以及第10天通過(guò)熱板測(cè)量熱痛閾潛伏期,在第10天用軟刷輕刷小鼠足底后,灌注取腦,取脊髓腰膨大以及腦組織,做脊髓腰膨大以及RVM區(qū)Fos免疫熒光染色。結(jié)果:單次電刺激小鼠硬腦膜相比與假刺激組可以引起小鼠后爪足底機(jī)械痛閾下降,以及TNC區(qū)、高頸段區(qū)域大量Fos蛋白表達(dá),提前給予腹腔注射舒馬曲普坦可以有效抑制機(jī)械痛閾的下降,并抑制TNC區(qū)以及高頸段區(qū)域Fos蛋白表達(dá)。重復(fù)電刺激硬腦膜可以引起小鼠后爪足底機(jī)械痛閾的進(jìn)行性下降,每天給予腹腔注射舒馬曲普坦并不能抑制該下降趨勢(shì),每天給予托吡酯則可以有效抑制后爪足底痛閾的下降,第10天電刺激+托吡酯組熱痛閾潛伏期明顯長(zhǎng)于電刺激+生理鹽水組以及電刺激+舒馬曲普坦組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,腰膨大區(qū)Fos熒光染色顯示,電刺激+舒馬曲普坦組以及電刺激+生理鹽水組Fos蛋白表達(dá)量明顯高于電刺激+托吡酯組,在RVM區(qū)的Fos染色也得到了相同的結(jié)果。結(jié)論:1.單次電刺激清醒小鼠上矢狀竇區(qū)硬腦膜可以模擬急性偏頭痛的痛覺(jué)敏化,并且該效應(yīng)可以被舒馬曲普坦所抑制。2.重復(fù)電刺激清醒小鼠上矢狀竇區(qū)硬腦膜可以出現(xiàn)痛覺(jué)敏化進(jìn)行性加重,每天給予舒馬曲普坦注射無(wú)法抑制慢性痛覺(jué)敏化的發(fā)展,而托吡酯可以有效抑制慢性痛覺(jué)敏化。3.電刺激硬腦膜模型所誘導(dǎo)的痛覺(jué)敏化可能與RVM區(qū)域的調(diào)節(jié)有著密切的關(guān)系。4.托吡酯的治療作用可能與抑制RVM區(qū)域神經(jīng)元的激活有關(guān)。第三部分急性睡眠剝奪顯著加重硝酸甘油所致的小鼠痛覺(jué)敏化目的:睡眠不足以及偏頭痛現(xiàn)已成為困擾全球的公共衛(wèi)生問(wèn)題。睡眠不足可以誘發(fā)偏頭痛的發(fā)生,而偏頭痛患者頭痛發(fā)作時(shí)又常常喜歡臥床休息。那么急性睡眠障礙是否會(huì)影響頭痛的程度以及持續(xù)時(shí)間呢,本研究以小鼠硝酸甘油模型為基礎(chǔ),探究急性睡眠剝奪對(duì)于小鼠痛覺(jué)敏化的影響。方法:第一部分:將32只C57小鼠隨機(jī)分為4組:睡眠剝奪+生理鹽水組,睡眠剝奪+硝酸甘油組,無(wú)睡眠剝奪+硝酸甘油組,無(wú)睡眠剝奪+生理鹽水組,給予睡眠剝奪6小時(shí)或無(wú)干擾6小時(shí)后,四組小鼠分別腹腔注射硝酸甘油或生理鹽水,Von-Frey纖維絲以及熱板試驗(yàn)分別每隔半個(gè)小時(shí)測(cè)量小鼠后爪機(jī)械閾值以及熱痛閾潛伏期,持續(xù)測(cè)量6小時(shí)。再重取24只小鼠先重復(fù)上述流程,而后分別在腹腔注射后2小時(shí)、4.5小時(shí)分批處死,取TNC區(qū)以及高頸段,進(jìn)行免疫熒光Fos染色。第二部分:再重新取32只小鼠隨機(jī)分為4組:生理鹽水+睡眠剝奪組,生理鹽水+無(wú)睡眠剝奪組,硝酸甘油+睡眠剝奪組,硝酸甘油+無(wú)睡眠剝奪組,在腹腔注射生理鹽水或者硝酸甘油后再予以睡眠剝奪6小時(shí)或無(wú)干擾6小時(shí),6小時(shí)后測(cè)足底機(jī)械痛閾以及熱痛閾潛伏期。結(jié)果:只給予睡眠剝奪6小時(shí)并不引起小鼠機(jī)械痛閾以及熱痛閾基線變化。提前給予睡眠剝奪可以顯著延長(zhǎng)硝酸甘油所引起的波谷持續(xù)時(shí)長(zhǎng)(即最低閾值持續(xù)的時(shí)長(zhǎng)),以及閾值下降的總時(shí)長(zhǎng)。2小時(shí)TNC區(qū)以及高頸段Fos表達(dá)量睡眠剝奪+硝酸甘油組及無(wú)睡眠剝奪+硝酸甘油組顯著高于其余兩組,但兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;4.5小時(shí)上述腦區(qū)域Fos表達(dá)量,睡眠剝奪+硝酸甘油組顯著高于無(wú)睡眠剝奪+硝酸甘油組,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。先給腹腔注射時(shí),硝酸甘油+睡眠剝奪組后爪機(jī)械痛閾明顯低于其余三組。結(jié)論:急性睡眠剝奪可以顯著加重硝酸甘油所致小鼠的痛覺(jué)敏化。
【圖文】：

基于激光散斑對(duì)比分析（Ｌａｓｅｒ邋Ｓｐｅｃｋｌｅ邋Ｃｏｎｔｒａｓｔ邋Ａｎａｌｙｓｉｓ／ＬＡＳＣＡ）技術(shù)，，可對(duì)大面積組逡逑織進(jìn)行實(shí)時(shí)的血流動(dòng)態(tài)成像監(jiān)測(cè)，為微循環(huán)研究提供提供了的全新方法）通過(guò)該設(shè)備逡逑觀察小鼠硬腦膜表面血流灌注情況（圖１－２）觀察待基線穩(wěn)定后，給予預(yù)實(shí)驗(yàn)選定的逡逑刺激強(qiáng)度，共刺激５分鐘，觀察小鼠硬腦膜血流在給予電刺激過(guò)程中是否會(huì)出現(xiàn)變化。逡逑｜邋ＪＨＩ邋；：邐／１逡逑圖１－２激光散斑血流灌注成像儀實(shí)驗(yàn)圖逡逑２．４實(shí)驗(yàn)分組逡逑當(dāng)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最適刺激強(qiáng)度后，將６９只小鼠隨機(jī)分為３組：①假刺激／生理鹽水組；逡逑②電刺激／生理鹽水組；③電刺激／舒馬曲普坦組。為了避免不同實(shí)驗(yàn)間的相互影響以逡逑及重復(fù)電刺激可能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾，在以下的實(shí)驗(yàn)中每只老鼠均只使用一次。將舒逡逑馬曲普坦溶解于生理鹽水后（１０邋ｍｇ／ｍｌ），通過(guò)腹腔注射的方式給予注射。逡逑組１假刺激／生理鹽水：術(shù)后恢復(fù)一周后，在行為學(xué)實(shí)驗(yàn)前３０分鐘給予腹腔注射生理鹽逡逑水，在測(cè)試中，將頭上的電極與電線以及電刺激器相連，N羰塹绱碳て鞔τ詮乇兆刺義喜煌ǖ紜ｅ義獻(xiàn)椋駁绱碳ぃ硌嗡菏鹺蠡指匆恢芎�，灾B形Р饈鄖埃常胺種癰韙骨蛔⑸瀋礤義涎嗡

本文編號(hào)：2616445