【摘要】：第一部分:電刺激清醒小鼠上矢狀竇區(qū)硬腦膜模擬偏頭痛相關行為學研究目的:偏頭痛動物模型的建立可以幫助我們探究偏頭痛的發(fā)生機制,尋找潛在的治療靶點,目前為止,尚沒有任何一種動物模型可以模擬出偏頭痛發(fā)生的整個階段。臨床上偏頭痛患者不僅具有頭痛還伴有畏光、不愿活動等特征,本實驗旨在通過電刺激清醒小鼠上矢狀竇區(qū)硬腦膜建立一種小鼠頭痛模型,并驗證其具有偏頭痛樣的相關行為。方法:C57小鼠通過手術暴露上矢狀竇區(qū)硬腦膜,并安置電極,預實驗給予不同強度電刺激,通過觀察小鼠行為學表現(xiàn)確定最適強度,同時在麻醉狀態(tài)下通過激光散斑血流成像儀驗證該強度是否會引發(fā)既往文獻報道的硬腦膜血流改變。最后通過手術建立69只C57小鼠模型,隨機將其分為3組,分別為:組1為假刺激+生理鹽水組(n=23);組2為電刺激+生理鹽水組(n=23),組3為電刺激+舒馬曲普坦組(n=23)。對這三組小鼠進行疼痛行為觀察、畏光實驗、以及水迷宮運動實驗,從而驗證該三組小鼠是否具有偏頭痛樣的行為學表現(xiàn)。結果:通過預實驗確定電刺激小鼠的強度為0.5mA/2Hz,麻醉狀態(tài)下該強度可以模擬出既往報道的血流變化。相比組1,組2給予電刺激后,小鼠表現(xiàn)出用后爪或者前爪搔抓頭皮和眼眶皮膚的時間明顯增長,在畏光實驗中在光亮部分停留時間變短,在黑暗及光亮之間穿梭次數(shù)減少,以及在運動實驗中表現(xiàn)為運動距離減少,組間差異均具有統(tǒng)計學意義。當組3提前給予舒馬曲普坦腹腔注射后,可以不同程度的抑制上述行為學的變化。結論:電刺激清醒小鼠上矢狀竇區(qū)硬腦膜可以模擬出類似于偏頭痛樣的行為學表現(xiàn),為將來藥物研究的行為觀察提供更多參考指標。第二部分:重復電刺激清醒小鼠上矢狀竇區(qū)硬腦膜時痛覺敏化形成特點及機制目的:慢性偏頭痛給患者帶來極大的疾病負擔,目前制約慢性偏頭痛新的治療手段發(fā)展的重要瓶頸之一就是缺乏有效的預測性動物模型。痛覺敏化作為偏頭痛的一項特征樣表現(xiàn),目前具體機制尚不清楚,本研究旨在通過重復電刺激清醒小鼠上矢狀竇區(qū)硬腦膜構建慢性偏頭痛模型,并初步探索偏頭痛痛覺敏化特點及機制。方法:將24只造模后小鼠隨機分為三組,組1:假刺激+生理鹽水組;組2:電刺激+生理鹽水組;組3:電刺激+舒馬曲普坦組。Vonfery纖維絲測量電刺激/假刺激后小鼠足底的機械痛閾變化,并麻醉灌注取腦進行TNC區(qū)以及高頸段的Fos蛋白染色。再將32只小鼠隨機分為4組:組1:假刺激+生理鹽水組;組2:電刺激+生理鹽水組;組3:電刺激+舒馬曲普坦組;組4:電刺激+托吡酯組,術后恢復一周后,每天分別給予四組腹腔注射生理鹽水、舒馬曲普坦或托吡酯,分別在1、3、5、7、9天給予電刺激或假刺激,刺激前測量小鼠后爪機械痛閾,分別于第1天以及第10天通過熱板測量熱痛閾潛伏期,在第10天用軟刷輕刷小鼠足底后,灌注取腦,取脊髓腰膨大以及腦組織,做脊髓腰膨大以及RVM區(qū)Fos免疫熒光染色。結果:單次電刺激小鼠硬腦膜相比與假刺激組可以引起小鼠后爪足底機械痛閾下降,以及TNC區(qū)、高頸段區(qū)域大量Fos蛋白表達,提前給予腹腔注射舒馬曲普坦可以有效抑制機械痛閾的下降,并抑制TNC區(qū)以及高頸段區(qū)域Fos蛋白表達。重復電刺激硬腦膜可以引起小鼠后爪足底機械痛閾的進行性下降,每天給予腹腔注射舒馬曲普坦并不能抑制該下降趨勢,每天給予托吡酯則可以有效抑制后爪足底痛閾的下降,第10天電刺激+托吡酯組熱痛閾潛伏期明顯長于電刺激+生理鹽水組以及電刺激+舒馬曲普坦組,差異具有統(tǒng)計學意義,腰膨大區(qū)Fos熒光染色顯示,電刺激+舒馬曲普坦組以及電刺激+生理鹽水組Fos蛋白表達量明顯高于電刺激+托吡酯組,在RVM區(qū)的Fos染色也得到了相同的結果。結論:1.單次電刺激清醒小鼠上矢狀竇區(qū)硬腦膜可以模擬急性偏頭痛的痛覺敏化,并且該效應可以被舒馬曲普坦所抑制。2.重復電刺激清醒小鼠上矢狀竇區(qū)硬腦膜可以出現(xiàn)痛覺敏化進行性加重,每天給予舒馬曲普坦注射無法抑制慢性痛覺敏化的發(fā)展,而托吡酯可以有效抑制慢性痛覺敏化。3.電刺激硬腦膜模型所誘導的痛覺敏化可能與RVM區(qū)域的調(diào)節(jié)有著密切的關系。4.托吡酯的治療作用可能與抑制RVM區(qū)域神經(jīng)元的激活有關。第三部分急性睡眠剝奪顯著加重硝酸甘油所致的小鼠痛覺敏化目的:睡眠不足以及偏頭痛現(xiàn)已成為困擾全球的公共衛(wèi)生問題。睡眠不足可以誘發(fā)偏頭痛的發(fā)生,而偏頭痛患者頭痛發(fā)作時又常常喜歡臥床休息。那么急性睡眠障礙是否會影響頭痛的程度以及持續(xù)時間呢,本研究以小鼠硝酸甘油模型為基礎,探究急性睡眠剝奪對于小鼠痛覺敏化的影響。方法:第一部分:將32只C57小鼠隨機分為4組:睡眠剝奪+生理鹽水組,睡眠剝奪+硝酸甘油組,無睡眠剝奪+硝酸甘油組,無睡眠剝奪+生理鹽水組,給予睡眠剝奪6小時或無干擾6小時后,四組小鼠分別腹腔注射硝酸甘油或生理鹽水,Von-Frey纖維絲以及熱板試驗分別每隔半個小時測量小鼠后爪機械閾值以及熱痛閾潛伏期,持續(xù)測量6小時。再重取24只小鼠先重復上述流程,而后分別在腹腔注射后2小時、4.5小時分批處死,取TNC區(qū)以及高頸段,進行免疫熒光Fos染色。第二部分:再重新取32只小鼠隨機分為4組:生理鹽水+睡眠剝奪組,生理鹽水+無睡眠剝奪組,硝酸甘油+睡眠剝奪組,硝酸甘油+無睡眠剝奪組,在腹腔注射生理鹽水或者硝酸甘油后再予以睡眠剝奪6小時或無干擾6小時,6小時后測足底機械痛閾以及熱痛閾潛伏期。結果:只給予睡眠剝奪6小時并不引起小鼠機械痛閾以及熱痛閾基線變化。提前給予睡眠剝奪可以顯著延長硝酸甘油所引起的波谷持續(xù)時長(即最低閾值持續(xù)的時長),以及閾值下降的總時長。2小時TNC區(qū)以及高頸段Fos表達量睡眠剝奪+硝酸甘油組及無睡眠剝奪+硝酸甘油組顯著高于其余兩組,但兩組間無統(tǒng)計學差異;4.5小時上述腦區(qū)域Fos表達量,睡眠剝奪+硝酸甘油組顯著高于無睡眠剝奪+硝酸甘油組,且差異具有統(tǒng)計學意義。先給腹腔注射時,硝酸甘油+睡眠剝奪組后爪機械痛閾明顯低于其余三組。結論:急性睡眠剝奪可以顯著加重硝酸甘油所致小鼠的痛覺敏化。
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基于激光散斑對比分析（Ｌａｓｅｒ邋Ｓｐｅｃｋｌｅ邋Ｃｏｎｔｒａｓｔ邋Ａｎａｌｙｓｉｓ／ＬＡＳＣＡ）技術，，可對大面積組逡逑織進行實時的血流動態(tài)成像監(jiān)測，為微循環(huán)研究提供提供了的全新方法）通過該設備逡逑觀察小鼠硬腦膜表面血流灌注情況（圖１－２）觀察待基線穩(wěn)定后，給予預實驗選定的逡逑刺激強度，共刺激５分鐘，觀察小鼠硬腦膜血流在給予電刺激過程中是否會出現(xiàn)變化。逡逑｜邋ＪＨＩ邋；：邐／１逡逑圖１－２激光散斑血流灌注成像儀實驗圖逡逑２．４實驗分組逡逑當預實驗確定最適刺激強度后，將６９只小鼠隨機分為３組：①假刺激／生理鹽水組；逡逑②電刺激／生理鹽水組；③電刺激／舒馬曲普坦組。為了避免不同實驗間的相互影響以逡逑及重復電刺激可能對實驗結果的干擾，在以下的實驗中每只老鼠均只使用一次。將舒逡逑馬曲普坦溶解于生理鹽水后（１０邋ｍｇ／ｍｌ），通過腹腔注射的方式給予注射。逡逑組１假刺激／生理鹽水：術后恢復一周后，在行為學實驗前３０分鐘給予腹腔注射生理鹽逡逑水，在測試中，將頭上的電極與電線以及電刺激器相連，N羰塹绱碳て鞔τ詮乇兆刺義喜煌ǖ紜ｅ義獻椋駁绱碳ぃ硌嗡菏鹺蠡指匆恢芎�，灾B形Р饈鄖埃常胺種癰韙骨蛔⑸瀋礤義涎嗡

本文編號：2616445