【摘要】：神經(jīng)膠質(zhì)瘤簡稱膠質(zhì)瘤,是最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤。目前主張綜合療法,以手術(shù)切除為主,術(shù)后配合放療、化療、免疫治療及生物治療等,通�？裳泳從[瘤復(fù)發(fā),延長病人生存期,但尚未取得滿意療效。開發(fā)新型有效的治療藥物仍然尤為重要。大環(huán)內(nèi)酯類藥物,具有高效廣譜性,研究發(fā)現(xiàn)可以逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥(MDR),對非耐藥腫瘤細(xì)胞具有殺傷性,而且這類藥物毒副作用小、療效佳,一般很少引起不良反應(yīng)。但由于缺乏相關(guān)的研究基礎(chǔ),大環(huán)內(nèi)酯類藥物作為抗腫瘤藥物的使用并不多。因此,本實(shí)驗(yàn)選用伊維菌素(Ivermectin,IVM)和莫西克汀(Moxidectin,MOX)檢測該類藥物對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長活力的影響,以初步了解藥物對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑制作用;在此基礎(chǔ)上利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡率和周期DNA含量的變化;透射電鏡觀察細(xì)胞凋亡特征;Western blotting和RT-PCR法分析線粒體相關(guān)凋亡蛋白和周期蛋白的表達(dá)量;在動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,利用免疫組織化學(xué)染色法(HE、TUNEL、Ki67、Cleaved caspase-3以及Cleaved caspase-9染色)研究了藥物對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑制、凋亡作用及機(jī)制,旨在開發(fā)一類膠質(zhì)瘤治療的有效藥物。研究結(jié)果如下:(1)伊維菌素、莫西克汀對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑制作用在體外,采用MTT方法檢測細(xì)胞的活力。結(jié)果表明,隨著藥物濃度的升高,其膠質(zhì)瘤細(xì)胞的活力明顯下降。其次,利用細(xì)胞平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測藥物對膠質(zhì)瘤細(xì)胞克隆形成能力的影響,結(jié)果顯示,隨著藥物濃度的升高,其克隆能力下降導(dǎo)致其集落形成率顯著降低。(2)伊維菌素、莫西克汀將膠質(zhì)瘤細(xì)胞阻滯在周期G0/G1期的作用及機(jī)制流式結(jié)果表明,與對照組相比,經(jīng)藥物處理48 h之后的G0/G1期DNA含量明顯增加,而S期明顯降低,且呈劑量依賴效應(yīng)(P0.001)。藥物處理之后用western blotting法檢測其周期蛋白表達(dá)量,結(jié)果顯示,CDK2、CDK4、CDK6、Cyclin D1和Cyclin E表達(dá)明顯下調(diào),且呈劑量依賴效應(yīng)。(3)伊維菌素、莫西克汀誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡的作用及機(jī)制在體內(nèi),TUNEL法檢測顯示,經(jīng)藥物處理之后的TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)與對照組相比明顯增加;在體外,流式結(jié)果表明,藥物處理48 h之后細(xì)胞凋亡率明顯高于對照組,且呈劑量依賴效應(yīng)(P0.001);另外,caspase酶活性檢測結(jié)果說明,隨著藥物濃度的增加,其caspase-3和caspase-9酶活性逐漸升高。隨后用western blotting、RT-PCR法檢測其凋亡蛋白表達(dá)量,結(jié)果表明,促凋亡蛋白Bax的表達(dá)顯著上調(diào),抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)明顯下調(diào),導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Cytochrome-c的釋放,從而激活caspase-3和caspase-9的表達(dá),且呈劑量依賴效應(yīng)。(4)伊維菌素、莫西克汀誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)變化透射電鏡結(jié)果顯示,藥物處理后的細(xì)胞呈現(xiàn)典型的凋亡特征:細(xì)胞皺縮、染色質(zhì)濃縮,細(xì)胞質(zhì)及大多數(shù)線粒體出現(xiàn)空泡化現(xiàn)象,同時(shí)伴隨一些凋亡小體及自噬泡的產(chǎn)生。(5)在膠質(zhì)瘤動物模型中,伊維菌素、莫西克汀對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑制作用及機(jī)制宏觀上,藥物處理之后的裸鼠腫瘤體積明顯小于對照組,差異性顯著(P0.01),而且藥物處理后,腫瘤生長緩慢;而裸鼠的體重在各組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);同時(shí),免疫組化檢測結(jié)果說明藥物處理后Ki67陽性細(xì)胞數(shù)與對照組相比明顯降低,而Cleaved caspase-3與Cleaved caspase-9的陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加(P0.01)。綜上,本研究表明,伊維菌素和莫西克汀在體外、體內(nèi)均能有效抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6和U251的增殖,同時(shí)在體外可以通過caspase途徑調(diào)節(jié)線粒體相關(guān)蛋白水平誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,下調(diào)相關(guān)周期蛋白的表達(dá)將細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期。因此,伊維菌素,莫西克汀可能成為治療膠質(zhì)瘤的有效藥物。
【圖文】：

圖 1-1 伊維菌素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1-1 Chemical structure of ivermectin克汀的發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用（MOX），作為新型抗寄生蟲藥，是由鏈霉菌發(fā)酵的單一成分的大

莫西克汀的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1-2Chemicalstructureofmoxidectin
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R739.41

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2612449