【摘要】：研究背景低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白4(Low-density lipoprotein receptor-related protein4,LRP4)抗體是一種新近發(fā)現(xiàn)的介導(dǎo)重癥肌無(wú)力(myasthenia gravis,MG)發(fā)病的分子。而MG是一種已被許多學(xué)者公認(rèn)的由自身抗體介導(dǎo)的免疫性疾病,由神經(jīng)肌肉接頭(neuromuscular junction,NMJ)的突觸傳遞受損所致。80%的MG患者可檢測(cè)到抗肌肉煙堿型乙酰膽堿受體(Acetylcholine receptor,AChR)AChR的自身抗體,約20%的MG患者是乙酰膽堿受體抗體陰性。最近,在2-27%沒(méi)有AChR和MuSK抗體的患者中發(fā)現(xiàn)了LRP4的自身抗體,并且動(dòng)物模型提示這些抗體的致病作用。目前關(guān)于MG終板膜的修復(fù)機(jī)制研究報(bào)道較為少見(jiàn)。而實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無(wú)力動(dòng)物模型(Experimental autoimmune myastheia gravis,EAMG)是研究MG的一種可靠的動(dòng)物模型,是用于研究疾病機(jī)制和/或治療該疾病的方法的重要工具,與人類中MG具有許多相似的免疫病理學(xué)和臨床特征,包括血清中抗AChR抗體的存在,NMJ上Ig G和補(bǔ)體的沉積,以及肌肉AChRs的喪失。目前常用人工合成鼠源的AChR-α亞單位97-116多段(R97-116)制備EAMG模型。最近,SNX17已被鑒定為低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein,LDL)受體家族的幾個(gè)成員的結(jié)合配偶體,且在預(yù)防含有NPxY基序的β1整聯(lián)蛋白、低密度脂蛋白受體和P-選擇蛋白溶酶體降解中起重要作用。本課題組前期發(fā)現(xiàn)MG患者肋間肌肌細(xì)胞中分揀微管連接蛋白17(Sorting nexin 17,SNX17)含量明顯增高,并與AChR共定位于NMJ處,通過(guò)雙向免疫共沉淀(Co-IP)及蛋白印跡(Western Blotting,WB)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了原核表達(dá)的LRP4胞內(nèi)區(qū)蛋白與真核表達(dá)的SNX17體外可發(fā)生直接結(jié)合,推測(cè)LRP4在MG患者NMJ處肌細(xì)胞內(nèi)通過(guò)與SNX17結(jié)合,逃避了溶酶體的降解途徑,直接插入細(xì)胞膜再循環(huán)利用,修復(fù)NMJ終板膜LRP4-MuSK-nAChR功能單元。為了了解肌細(xì)胞SNX17、LRP4的表達(dá)特點(diǎn),本實(shí)驗(yàn)分別從細(xì)胞水平和動(dòng)物水平運(yùn)用WB、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)技術(shù)進(jìn)行分析。目的利用誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞分化并給予處理及采用人工合成鼠源性AChR-α亞單位97~116肽段建立EAMG大鼠模型,運(yùn)用WB、qRT-PCR技術(shù)分析SNX17、LRP4在不同骨骼肌細(xì)胞中的表達(dá)特點(diǎn)。方法1.原代C2C12細(xì)胞的分化及處理:從SD大鼠胎鼠(1-2天)提取C2C12成肌原代細(xì)胞,并用2%馬血清誘導(dǎo)分化,然后分為空白對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)處理組,分別給予加入AChR抗體陽(yáng)性的MG患者血清處理(AChRAb組)及加入兔抗鼠的LRP4抗體(1:1000)處理(LRP4Ab組),并分別收集0h、0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h時(shí)的處理細(xì)胞。2.EAMG實(shí)驗(yàn)大鼠模型的建立:采取主動(dòng)免疫法。將20只健康雌性LEWIS大鼠(6-8周,體重150-160g),按照隨機(jī)數(shù)字法隨機(jī)分為兩組,對(duì)照組10只,實(shí)驗(yàn)組10只。采用鼠源性AChR-α亞單位97~116肽段為免疫原誘導(dǎo)模型組LEWIS大鼠建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。正常對(duì)照組給予注射相同劑量的佐劑與PBS。初次免疫第30天及第45天分別于同等部位給予同等劑量免疫。第三次免疫一周后開(kāi)始評(píng)價(jià)模型。以Lennon分級(jí)評(píng)分≥1分,ELISA法測(cè)定AChR-Ab呈陽(yáng)性,同時(shí)低頻(5Hz)重復(fù)電刺激后,腓腸肌肌電圖在第5次出現(xiàn)衰減幅度大于10%為EAMG大鼠模型造模成功標(biāo)準(zhǔn)。3.qRT-PCR法檢測(cè)肌細(xì)胞SNX17、nAChRβ1亞基、LRP4、MuSK分子mRNA含量:5%水合氯醛麻醉大鼠,取出眼肌、咀嚼肌、腓腸肌肌肉組織,預(yù)冷PBS洗滌2次,每組肌群各稱取40mg肌肉液氮下勻漿,用Trizol一步法提取RNA,并按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書將RNA反轉(zhuǎn)成cDNA。Premier5.0設(shè)計(jì)引物,SNX17上游引物序列GACGACGATGTCATGGAGAA,下游引物序AGATTTGAGCTGTCGGTGCT,擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度117bp;nAChRβ1亞單位其上游引物為AGCCTGAACGAGAAGGATGA,下游引物為TGACACGGAGAGACTCGATG,擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度119bp;LRP4上游引物序列:GATGGTTCCTGTCGCAAAGT,下游引物序列,CGTTCAATCTTGGCAATGTG,擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度122bp;MuSK上游引物序列ACCCCAACATTGTGAAGCTC,下游引物序列AGTGTGAGGGGACATGCTTC,擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度119bp;β-actin作為內(nèi)參,其上游引物序列為TGTCACCAACTGGGACGATA,下游引物序列為GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA,擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度165bp,均由上海生工合成。qPCR法采用20ul反應(yīng)體系,熒光預(yù)變性反應(yīng)條件為95℃30 S;PCR的反應(yīng)條件為95℃5 S、55℃30S,45個(gè)循環(huán)。采用相對(duì)表達(dá)量2~(-△△ct)的方法算出各個(gè)目的基因的相對(duì)表達(dá)量。4.WB法檢測(cè)肌細(xì)胞SNX17、LRP4、EEA1蛋白含量:取出上述各肌肉組織,加入RIPA細(xì)胞裂解液,冰上裂解30 min,在超低溫離心機(jī)以12000 rpm的速度離心5 min,然后取上清,采用BCA法進(jìn)行檢測(cè)細(xì)胞蛋白的濃度,每個(gè)孔加入6ul樣品,GAPDH作為內(nèi)參,小鼠抗大鼠SNX17抗體(1:500)、小鼠抗大鼠LRP4抗體(1:1000)、兔抗大鼠EEA1(1:1000)及兔抗鼠GAPDH抗體(1:1000)一抗孵育4℃過(guò)夜,第二天37℃復(fù)溫0.5 h,HRP標(biāo)記的羊抗小鼠抗體(1:10000)和HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體(1:10000)37℃孵育1 h,然后曝光,采用圖像分析軟件Quantity One分別進(jìn)行測(cè)定目的基因和GAPDH的顯色條帶平均值,各組蛋白表達(dá)強(qiáng)度為二者平均值的比值。結(jié)果1.細(xì)胞水平:成功誘導(dǎo)分化C2C12肌管細(xì)胞,與空白對(duì)照組相比,AChRAb組SNX17、LRP4基因表達(dá)含量均上調(diào),差異顯著均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),且隨時(shí)間的增加表達(dá)增強(qiáng),1.5小時(shí)之后組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);LRP4Ab組SNX17基因表達(dá)含量降低,而LRP4基因表達(dá)含量升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。2.動(dòng)物水平:按照EAMG大鼠模型成功造模標(biāo)準(zhǔn),本次實(shí)驗(yàn)共納入8只EAMG模型大鼠。基因檢測(cè)結(jié)果顯示,EAMG大鼠眼肌MuSK和nAChRβ1亞單位基因表達(dá)較正常組顯著下降(p0.05),而咀嚼肌和腓腸肌中兩者變化不大;LRP4、SNX17在三組肌群均無(wú)明顯改變。WB結(jié)果顯示,EAMG大鼠眼肌LRP4蛋白顯著降低(p0.01),而EEA1蛋白表達(dá)增加(p0.05),但該蛋白在腓腸肌中表達(dá)下降(P0.01);腓腸肌SNX17蛋白含量增加顯著(p0.01)。結(jié)論1.使用不同的MG自身抗體刺激,SNX17、LRP4在細(xì)胞水平呈現(xiàn)不同變化的特點(diǎn),說(shuō)明LRP4Ab和AChRAb引起的肌細(xì)胞反應(yīng)是不一樣的,LRP4Ab組SNX17、LRP4基因表達(dá)均增加,而AChRAb組SNX17基因表達(dá)含量降低,LRP4基因表達(dá)含量增加;2.動(dòng)物水平AChRAb引起的眼肌、咀嚼肌和腓腸肌肌細(xì)胞SNX17、LRP4等終板膜相關(guān)蛋白變化不同,其中眼肌LRP4、MuSK和nAChRβ1亞單位表達(dá)均明顯降低,SNX17蛋白在腓腸肌中表達(dá)顯著增加,可部分解釋AChRAb介導(dǎo)的重癥肌無(wú)力易累及眼肌的原因。
【圖文】：

MuSK 基因在眼肌(n=5，0.25±0.02，p < 0.05)表達(dá)下調(diào)，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)圖 5)。2.3 蛋白水平結(jié)果EAMG 組較對(duì)照組 SNX17 蛋白在咀嚼�。╰=14.473，p < 0.01）、腓腸肌（t=3.788，，p < 0.05）表達(dá)增加，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；LRP4 蛋白在眼肌（t=-3.31，p < 0.05）表達(dá)降低，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；EEA1 蛋白在眼肌（t=4.87，p < 0.05）表達(dá)增加，而在腓腸肌（t=-6.26，p < 0.01）表達(dá)降低，其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見(jiàn)圖 6）。

圖1 A為SD大鼠C2C12細(xì)胞傳代后第1天（100×），B為C2C12細(xì)胞傳代后第2天（100×），C 為傳代后第 3 天（100×），D 為誘導(dǎo)分化后第 1 天（100×），E 為誘導(dǎo)分化后第 2 天（100×），F(xiàn) 為誘導(dǎo)分化后第 3 天（100×）
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R746.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2610913