【摘要】：多形性膠質(zhì)母細胞瘤(GBM)為世界衛(wèi)生組織劃分的IV膠質(zhì)瘤,是最常見和最具侵襲性的腦腫瘤。根據(jù)腫瘤的發(fā)病史,GBM可以分為兩類:90%以上的GBM是原發(fā)性腫瘤,其余不到10%的是從低級(I-III級)膠質(zhì)瘤發(fā)展來的(繼發(fā)性腫瘤)。GBM的發(fā)病率隨年齡增加而升高,在50-60之間達到一個高峰。目前用于新確診的GBM病人的治療方案是Roger提出的放療一月后輔以6個月的150 200mg/m~2劑量的替莫唑胺治療,相對于以往的放療期間輔以低劑量替莫唑胺的治療方案,GBM病人的平均生存期提高了3個月并且存活24個月的病人數(shù)提高了10%。盡管如此,GBM患者的生存仍然很短,因此尋找新的治療靶點尤為迫切。Bach1(BTB和CNC的同源異聚體1)屬于亮氨酸拉鏈因子家族的一員,含有兩個具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的結(jié)構(gòu)域:CNC-bZIP和BTB/POZ。不同于其他的堿性亮氨酸拉鏈因子,Bach1是一個相對特殊的轉(zhuǎn)錄因子。Bach1可以與含有Maf結(jié)構(gòu)域的蛋白形成二聚體并結(jié)合在基因組上的Maf識別區(qū)域抑制靶基因轉(zhuǎn)錄。自從Bach1被發(fā)現(xiàn)以后,體外實驗已經(jīng)證明了其在癌細胞轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用。研究證明Bach1通過上調(diào)轉(zhuǎn)移性基因CXCR4和MMP1,參與乳腺癌的骨轉(zhuǎn)移。關(guān)于Bach1作為遷移和侵襲作用因子仍需要進一步的研究證實。關(guān)于參與癌癥轉(zhuǎn)移進程相關(guān)基因及信號通路的研究對提供有效的治療方案是至關(guān)重要的,尋找Bach1在癌癥轉(zhuǎn)移調(diào)控中更多的靶基因是必要的。關(guān)于Bach1在不同癌癥中作用還存在很大爭議,且其在膠質(zhì)母細胞瘤中的作用機制尚不清楚。因此,進一步研究Bach1在不同癌癥中的作用及具體機制,分析其表達與癌癥病人預(yù)后的關(guān)系,才能對Bach1成為癌癥治療的潛在靶點提供更好的理論依據(jù)。本研究目前取得的研究結(jié)果如下:1、Bach1在膠質(zhì)母細胞瘤中的表達降低并與患者的預(yù)后密切相關(guān)為了更好的研究Bach1在膠質(zhì)母細胞瘤中的作用,我們通過對膠質(zhì)瘤病人的組織芯片進行IHC染色分析了Bach1的表達與膠質(zhì)瘤分級的關(guān)系。我們發(fā)現(xiàn)相對于正常組織,Bach1在膠質(zhì)瘤中的表達降低,并且隨著膠質(zhì)瘤級別的升高,Bach1的表達逐漸降低,其在膠質(zhì)母細胞瘤中的表達最低。隨后,我們利用免疫印跡技術(shù)檢測了Bach1在幾種膠質(zhì)母細胞瘤細胞系和正常膠質(zhì)細胞中的表達情況。同樣地,相對于正常膠質(zhì)細胞,Bach1在膠質(zhì)母細胞瘤細胞系中的表達也是降低的。為了研究Bach1的表達與膠質(zhì)母細胞瘤患者預(yù)后之間的關(guān)系,我們分析了TCGA數(shù)據(jù)庫中Bach1的表達對患者生存的影響。結(jié)果顯示,Bach1的低表達與膠質(zhì)母細胞瘤患者生存率的減少密切相關(guān)。這一結(jié)果說明Bach1在膠質(zhì)母細胞瘤中扮演一個抑癌基因的角色。因此,Bach1有成為膠質(zhì)母細胞瘤臨床診斷和預(yù)后分析指標的潛在可能。2、Bach1抑制膠質(zhì)母細胞瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移和腫瘤生長為闡釋Bach1在膠質(zhì)母細胞瘤中的作用,我們構(gòu)建了一組Bach1穩(wěn)定過表達或沉默的膠質(zhì)母細胞瘤細胞系。MTT實驗結(jié)果顯示,過表達Bach1抑制細胞增殖能力,而敲低Bach1可以促進細胞增殖。此外,BrdU摻入實驗結(jié)果顯示,Bach1過表達的細胞中DNA的合成相對于對照組細胞降低了30%左右。以上結(jié)果表明Bach1可以抑制膠質(zhì)母細胞瘤細胞的增殖,同樣的結(jié)果在軟瓊脂克隆實驗中得到了證實。為進一步研究Bach1對膠質(zhì)母細胞瘤細胞的生物學(xué)影響,我們利用流式細胞儀檢測了U87和U251細胞的細胞周期,發(fā)現(xiàn)過表達Bach1將膠質(zhì)母細胞瘤的細胞周期阻滯在G1期。隨后,我們利用Transwell實驗研究了Bach1對細胞轉(zhuǎn)移的影響。過表達Bach1可以顯著抑制膠質(zhì)母細胞瘤細胞的遷移及侵襲,相反沉默Bach1可以促進細胞轉(zhuǎn)移。為了研究Bach1在膠質(zhì)母細胞瘤細胞成瘤中的作用,我們通過皮下注射將Bach1過表達的U87細胞和對照組細胞接種到裸鼠體內(nèi),發(fā)現(xiàn)過表達Bach1顯著抑制腫瘤生長。此外,將上述細胞原位接種到裸鼠顱內(nèi),發(fā)現(xiàn)過表達Bach1可以抑制腫瘤生長并延長小鼠的生存期。以上結(jié)果說明,Bach1在膠質(zhì)母細胞瘤中扮演一個抑癌基因的角色,抑制膠質(zhì)母細胞瘤的發(fā)生進程。3、Bach1直接抑制Cyclin D1和MMP2的轉(zhuǎn)錄為探究Bach1抑制膠質(zhì)母細胞瘤發(fā)生進程的分子機制,我們檢測一些細胞周期及細胞轉(zhuǎn)移調(diào)控相關(guān)的關(guān)鍵基因的表達。我們篩選到Cyclin D1和MMP2是Bach1的下游基因。為證實Bach1是否直接調(diào)控Cyclin D1和MMP2的轉(zhuǎn)錄,我們構(gòu)建了一系列包含不同的Cyclin D1和MMP2啟動子區(qū)域的報告載體,利用雙熒光素酶報告實驗,證明Bach1可以結(jié)合到Cyclin D1和MMP2的啟動子上并抑制它們的基因轉(zhuǎn)錄。為了進一步尋找與Bach1直接結(jié)合的Cyclin D1和MMP2啟動子區(qū)域,我們對U87細胞進行了染色質(zhì)免疫共沉淀實驗(ChIP)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Bach1可以結(jié)合到Cyclin D1啟動子 183到 1和MMP2啟動子 232到 1區(qū)域。隨后,我們對與Bach1結(jié)合的Cyclin D1和MMP2啟動子序列分析,發(fā)現(xiàn)它們都存在一個TCF/lef識別位點T A/T(G/C)C A/T A A G。將這一位點突變后進行雙熒光素酶報告實驗,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Bach1并不能抑制這些TCF/lef識別位點突變的啟動子的活性。以上結(jié)果充分說明,Bach1通過直接結(jié)合到Cyclin D1和MMP2啟動子上的TCF/lef識別位點抑制它們的轉(zhuǎn)錄。4、Bach1抑制Cyclin D1、MMP2的轉(zhuǎn)錄和GBM生長依賴于BTB結(jié)構(gòu)域Bach1作為一個結(jié)合蛋白,往往不能直接結(jié)合到基因組的啟動子上。我們通過大數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)能同時識別并結(jié)合到Cyclin D1和MMP2啟動子上TCF/lef識別位點的轉(zhuǎn)錄因子只有TCF4。隨后,我們證實Bach1與TCF4在膠質(zhì)母細胞瘤細胞中可以相互結(jié)合并且在293FT細胞中也存在外源性結(jié)合。Bach1存在兩個蛋白結(jié)合的結(jié)構(gòu)域,BTB結(jié)構(gòu)域和bZip-CNC結(jié)構(gòu)域。為了尋找發(fā)揮功能結(jié)構(gòu)域,我們構(gòu)建了缺失不同結(jié)構(gòu)域的Bach1表達載體。我們利用免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn)Bach1與TCF4結(jié)合依賴于BTB結(jié)構(gòu)域而不是CNC結(jié)構(gòu)域。此外,將缺失不同結(jié)構(gòu)域的Bach1表達載體與Cyclin D1和MMP2啟動子報告載體共轉(zhuǎn)到293FT細胞中,利用雙熒光素酶報告實驗發(fā)現(xiàn)Bach1抑制Cyclin D1和MMP2的轉(zhuǎn)錄依賴于BTB結(jié)構(gòu)域。最后,我們利用MTT增殖和Transwell實驗發(fā)現(xiàn),Bach1抑制GBM細胞生長與轉(zhuǎn)移的功能域也是依賴于其BTB結(jié)構(gòu)域。這些結(jié)果表明Bach1抑制Cyclin D1和MMP2轉(zhuǎn)錄和GBM生長依賴于BTB結(jié)構(gòu)域。5、激活經(jīng)典Wnt通路可以挽救Bach1過表達引起的效應(yīng)以往研究發(fā)現(xiàn),Bach1可以抑制Wnt下游的IL-8和VEGF的表達進而誘導(dǎo)血管新生的減少。激活經(jīng)典Wnt通路后,由Bach1引起的血管生成抑制得到恢復(fù)。Cyclin D1和MMP2又是經(jīng)典Wnt通路的下游靶基因,因此我們檢測了Wnt通路對Bach1的影響。我們利用Wnt3a激活經(jīng)典Wnt通路后,由Bach1過表達引起的膠質(zhì)母細胞瘤細胞增殖的抑制得到一定程度的恢復(fù)。同樣的,激活經(jīng)典Wnt通路后,細胞轉(zhuǎn)移能力也得到了恢復(fù)。進一步的研究發(fā)現(xiàn),激活經(jīng)典Wnt通路減少了Bach1與TCF4的結(jié)合而不是抑制Bach1的表達。染色質(zhì)免疫共沉淀和雙熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示,激活經(jīng)典Wnt后,Bach1從Cyclin D1和MMP2啟動子上分離出來,進而解除了Bach1對Cyclin D1和MMP2啟動子活性的抑制。這些實驗結(jié)果表明,激活經(jīng)典Wnt通路解除了Bach1與Cyclin D1和MMP2啟動子的結(jié)合,恢復(fù)了由Bach1過表達引起的生物學(xué)效應(yīng)。6、Bach1是miR-155-5p的一個直接作用靶點為尋找Bach1在膠質(zhì)母細胞瘤中的表達下降的具體作用機制,我們把關(guān)注點放在miRNA上。首先基于生物信息學(xué)及臨床數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),在膠質(zhì)母細胞瘤中,Bach1是miR-155-5p的一個潛在作用靶點。為驗證這一推測,我們把與miR-155-5p結(jié)合位點的Bach1 3′UTR構(gòu)建到pGL3-basic載體上,與miR-155-5p mimics和NC共轉(zhuǎn)染到293FT細胞中,我們利用雙熒光素酶報告實驗發(fā)現(xiàn),miR-155-5p可以結(jié)合到Bach1的mRNA上并抑制它的表達。此外,miR-155-5p可以促進細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。進一步通過對過表達miR-155-5p的U87細胞恢復(fù)表達缺失不同結(jié)構(gòu)域的Bach1,利用MTT實驗證明:在膠質(zhì)母細胞瘤中,Bach1的BTB結(jié)構(gòu)域起到的的功能域作用;Bach1是miR-155-5p的功能靶點。
【圖文】：

28]。Maf 的同源二聚體和 CNC-Maf 的異源二聚體都要結(jié)合到 Maf上[11]。Bach 家族成員都包含一個 BTB 結(jié)構(gòu)域和 bZIP 結(jié)構(gòu)域，其中是與其他蛋白結(jié)合的功能域[29-31]。Bach 蛋白最明顯的特征是 BTB 結(jié)P 結(jié)構(gòu)域的新穎組合，這是其他鋅指蛋白家族和 bZIP 蛋白家族不具有TB 結(jié)構(gòu)域的蛋白家族在果蠅的發(fā)育中發(fā)揮各種各樣的作用，包括染色態(tài)發(fā)育、早期胚胎的特異起源、感光細胞的發(fā)育、神經(jīng)連接的形成和2-34]。在這些最新鑒定的含有 BTB 結(jié)構(gòu)域的蛋白中，Bach 家族是第一 結(jié)構(gòu)域的[1, 35]。Bach1 和 Bach2 作為用于具有功能性 NF-E2 位點的啟調(diào)節(jié)因子，也可以抑制成纖維細胞的基因轉(zhuǎn)錄。與已知 CNC 家族蛋白作用不同，Bach 蛋白的轉(zhuǎn)錄阻遏活性是獨特的[36, 37]。Bach 家族成員的結(jié)構(gòu)和功能特點參與 MafK 的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。因此，它們可以通過與小結(jié)合發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活或轉(zhuǎn)錄抑制的作用[38, 39]。總之，Bach 蛋白通過亮氨afK 或其他的 bZIP 蛋白形成異源二聚體結(jié)合到 DNA 上 TRE 或 NF-E2ach 蛋白還可以通過其 BTB 結(jié)構(gòu)域與其他的蛋白相互作用[1, 40]（圖 1

圖 1.2 Bach1 和小 Maf 異源二聚體的功能[12]Fig.1.2 BACH1/small Maf heterodimer and its function[12]值得注意的是，，為了研究參與 Bach1 在細胞代謝、氧化應(yīng)激反應(yīng)和細胞周期調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的先子，Warnatz 及其同事報道了一個獨特的平臺。他們使用三種不同的小干擾 RNA 在 HEK細胞中敲低 Bach1 表達，然后進行染色質(zhì)免疫沉淀測序分析（ChIP-seq）。敲低 Bach1 后，們通過 ChIP-seq 發(fā)現(xiàn)了 59 個靶基因參與細胞功能的調(diào)控[5]（表 1.2）。表 1.2 Bach1 下游基因及功能1.2.2 Bach1 與血管生成Cellular processes Bach1 target genesHeme degradation HMOX1, FTL, FTH1, ME1, SLC48A1Redox regulation GCLC,GCLM, SLC7A11Cell cycle and apoptosis pathways ITPR2, CALM1, TFE3, EWSR1, CDK6, BCL2L11Subcellular transport processes CLSTN1, PSAP, MAPT, vault RNA
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R739.4

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本文編號：2608927