【摘要】：多形性膠質母細胞瘤(GBM)為世界衛(wèi)生組織劃分的IV膠質瘤,是最常見和最具侵襲性的腦腫瘤。根據(jù)腫瘤的發(fā)病史,GBM可以分為兩類:90%以上的GBM是原發(fā)性腫瘤,其余不到10%的是從低級(I-III級)膠質瘤發(fā)展來的(繼發(fā)性腫瘤)。GBM的發(fā)病率隨年齡增加而升高,在50-60之間達到一個高峰。目前用于新確診的GBM病人的治療方案是Roger提出的放療一月后輔以6個月的150 200mg/m~2劑量的替莫唑胺治療,相對于以往的放療期間輔以低劑量替莫唑胺的治療方案,GBM病人的平均生存期提高了3個月并且存活24個月的病人數(shù)提高了10%。盡管如此,GBM患者的生存仍然很短,因此尋找新的治療靶點尤為迫切。Bach1(BTB和CNC的同源異聚體1)屬于亮氨酸拉鏈因子家族的一員,含有兩個具有轉錄調控作用的結構域:CNC-bZIP和BTB/POZ。不同于其他的堿性亮氨酸拉鏈因子,Bach1是一個相對特殊的轉錄因子。Bach1可以與含有Maf結構域的蛋白形成二聚體并結合在基因組上的Maf識別區(qū)域抑制靶基因轉錄。自從Bach1被發(fā)現(xiàn)以后,體外實驗已經(jīng)證明了其在癌細胞轉移中發(fā)揮了重要作用。研究證明Bach1通過上調轉移性基因CXCR4和MMP1,參與乳腺癌的骨轉移。關于Bach1作為遷移和侵襲作用因子仍需要進一步的研究證實。關于參與癌癥轉移進程相關基因及信號通路的研究對提供有效的治療方案是至關重要的,尋找Bach1在癌癥轉移調控中更多的靶基因是必要的。關于Bach1在不同癌癥中作用還存在很大爭議,且其在膠質母細胞瘤中的作用機制尚不清楚。因此,進一步研究Bach1在不同癌癥中的作用及具體機制,分析其表達與癌癥病人預后的關系,才能對Bach1成為癌癥治療的潛在靶點提供更好的理論依據(jù)。本研究目前取得的研究結果如下:1、Bach1在膠質母細胞瘤中的表達降低并與患者的預后密切相關為了更好的研究Bach1在膠質母細胞瘤中的作用,我們通過對膠質瘤病人的組織芯片進行IHC染色分析了Bach1的表達與膠質瘤分級的關系。我們發(fā)現(xiàn)相對于正常組織,Bach1在膠質瘤中的表達降低,并且隨著膠質瘤級別的升高,Bach1的表達逐漸降低,其在膠質母細胞瘤中的表達最低。隨后,我們利用免疫印跡技術檢測了Bach1在幾種膠質母細胞瘤細胞系和正常膠質細胞中的表達情況。同樣地,相對于正常膠質細胞,Bach1在膠質母細胞瘤細胞系中的表達也是降低的。為了研究Bach1的表達與膠質母細胞瘤患者預后之間的關系,我們分析了TCGA數(shù)據(jù)庫中Bach1的表達對患者生存的影響。結果顯示,Bach1的低表達與膠質母細胞瘤患者生存率的減少密切相關。這一結果說明Bach1在膠質母細胞瘤中扮演一個抑癌基因的角色。因此,Bach1有成為膠質母細胞瘤臨床診斷和預后分析指標的潛在可能。2、Bach1抑制膠質母細胞瘤細胞增殖、轉移和腫瘤生長為闡釋Bach1在膠質母細胞瘤中的作用,我們構建了一組Bach1穩(wěn)定過表達或沉默的膠質母細胞瘤細胞系。MTT實驗結果顯示,過表達Bach1抑制細胞增殖能力,而敲低Bach1可以促進細胞增殖。此外,BrdU摻入實驗結果顯示,Bach1過表達的細胞中DNA的合成相對于對照組細胞降低了30%左右。以上結果表明Bach1可以抑制膠質母細胞瘤細胞的增殖,同樣的結果在軟瓊脂克隆實驗中得到了證實。為進一步研究Bach1對膠質母細胞瘤細胞的生物學影響,我們利用流式細胞儀檢測了U87和U251細胞的細胞周期,發(fā)現(xiàn)過表達Bach1將膠質母細胞瘤的細胞周期阻滯在G1期。隨后,我們利用Transwell實驗研究了Bach1對細胞轉移的影響。過表達Bach1可以顯著抑制膠質母細胞瘤細胞的遷移及侵襲,相反沉默Bach1可以促進細胞轉移。為了研究Bach1在膠質母細胞瘤細胞成瘤中的作用,我們通過皮下注射將Bach1過表達的U87細胞和對照組細胞接種到裸鼠體內(nèi),發(fā)現(xiàn)過表達Bach1顯著抑制腫瘤生長。此外,將上述細胞原位接種到裸鼠顱內(nèi),發(fā)現(xiàn)過表達Bach1可以抑制腫瘤生長并延長小鼠的生存期。以上結果說明,Bach1在膠質母細胞瘤中扮演一個抑癌基因的角色,抑制膠質母細胞瘤的發(fā)生進程。3、Bach1直接抑制Cyclin D1和MMP2的轉錄為探究Bach1抑制膠質母細胞瘤發(fā)生進程的分子機制,我們檢測一些細胞周期及細胞轉移調控相關的關鍵基因的表達。我們篩選到Cyclin D1和MMP2是Bach1的下游基因。為證實Bach1是否直接調控Cyclin D1和MMP2的轉錄,我們構建了一系列包含不同的Cyclin D1和MMP2啟動子區(qū)域的報告載體,利用雙熒光素酶報告實驗,證明Bach1可以結合到Cyclin D1和MMP2的啟動子上并抑制它們的基因轉錄。為了進一步尋找與Bach1直接結合的Cyclin D1和MMP2啟動子區(qū)域,我們對U87細胞進行了染色質免疫共沉淀實驗(ChIP)。結果發(fā)現(xiàn)Bach1可以結合到Cyclin D1啟動子 183到 1和MMP2啟動子 232到 1區(qū)域。隨后,我們對與Bach1結合的Cyclin D1和MMP2啟動子序列分析,發(fā)現(xiàn)它們都存在一個TCF/lef識別位點T A/T(G/C)C A/T A A G。將這一位點突變后進行雙熒光素酶報告實驗,結果發(fā)現(xiàn)Bach1并不能抑制這些TCF/lef識別位點突變的啟動子的活性。以上結果充分說明,Bach1通過直接結合到Cyclin D1和MMP2啟動子上的TCF/lef識別位點抑制它們的轉錄。4、Bach1抑制Cyclin D1、MMP2的轉錄和GBM生長依賴于BTB結構域Bach1作為一個結合蛋白,往往不能直接結合到基因組的啟動子上。我們通過大數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)能同時識別并結合到Cyclin D1和MMP2啟動子上TCF/lef識別位點的轉錄因子只有TCF4。隨后,我們證實Bach1與TCF4在膠質母細胞瘤細胞中可以相互結合并且在293FT細胞中也存在外源性結合。Bach1存在兩個蛋白結合的結構域,BTB結構域和bZip-CNC結構域。為了尋找發(fā)揮功能結構域,我們構建了缺失不同結構域的Bach1表達載體。我們利用免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn)Bach1與TCF4結合依賴于BTB結構域而不是CNC結構域。此外,將缺失不同結構域的Bach1表達載體與Cyclin D1和MMP2啟動子報告載體共轉到293FT細胞中,利用雙熒光素酶報告實驗發(fā)現(xiàn)Bach1抑制Cyclin D1和MMP2的轉錄依賴于BTB結構域。最后,我們利用MTT增殖和Transwell實驗發(fā)現(xiàn),Bach1抑制GBM細胞生長與轉移的功能域也是依賴于其BTB結構域。這些結果表明Bach1抑制Cyclin D1和MMP2轉錄和GBM生長依賴于BTB結構域。5、激活經(jīng)典Wnt通路可以挽救Bach1過表達引起的效應以往研究發(fā)現(xiàn),Bach1可以抑制Wnt下游的IL-8和VEGF的表達進而誘導血管新生的減少。激活經(jīng)典Wnt通路后,由Bach1引起的血管生成抑制得到恢復。Cyclin D1和MMP2又是經(jīng)典Wnt通路的下游靶基因,因此我們檢測了Wnt通路對Bach1的影響。我們利用Wnt3a激活經(jīng)典Wnt通路后,由Bach1過表達引起的膠質母細胞瘤細胞增殖的抑制得到一定程度的恢復。同樣的,激活經(jīng)典Wnt通路后,細胞轉移能力也得到了恢復。進一步的研究發(fā)現(xiàn),激活經(jīng)典Wnt通路減少了Bach1與TCF4的結合而不是抑制Bach1的表達。染色質免疫共沉淀和雙熒光素酶報告實驗結果顯示,激活經(jīng)典Wnt后,Bach1從Cyclin D1和MMP2啟動子上分離出來,進而解除了Bach1對Cyclin D1和MMP2啟動子活性的抑制。這些實驗結果表明,激活經(jīng)典Wnt通路解除了Bach1與Cyclin D1和MMP2啟動子的結合,恢復了由Bach1過表達引起的生物學效應。6、Bach1是miR-155-5p的一個直接作用靶點為尋找Bach1在膠質母細胞瘤中的表達下降的具體作用機制,我們把關注點放在miRNA上。首先基于生物信息學及臨床數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),在膠質母細胞瘤中,Bach1是miR-155-5p的一個潛在作用靶點。為驗證這一推測,我們把與miR-155-5p結合位點的Bach1 3′UTR構建到pGL3-basic載體上,與miR-155-5p mimics和NC共轉染到293FT細胞中,我們利用雙熒光素酶報告實驗發(fā)現(xiàn),miR-155-5p可以結合到Bach1的mRNA上并抑制它的表達。此外,miR-155-5p可以促進細胞的增殖和轉移。進一步通過對過表達miR-155-5p的U87細胞恢復表達缺失不同結構域的Bach1,利用MTT實驗證明:在膠質母細胞瘤中,Bach1的BTB結構域起到的的功能域作用;Bach1是miR-155-5p的功能靶點。
【圖文】：

28]。Maf 的同源二聚體和 CNC-Maf 的異源二聚體都要結合到 Maf上[11]。Bach 家族成員都包含一個 BTB 結構域和 bZIP 結構域，其中是與其他蛋白結合的功能域[29-31]。Bach 蛋白最明顯的特征是 BTB 結P 結構域的新穎組合，這是其他鋅指蛋白家族和 bZIP 蛋白家族不具有TB 結構域的蛋白家族在果蠅的發(fā)育中發(fā)揮各種各樣的作用，包括染色態(tài)發(fā)育、早期胚胎的特異起源、感光細胞的發(fā)育、神經(jīng)連接的形成和2-34]。在這些最新鑒定的含有 BTB 結構域的蛋白中，Bach 家族是第一 結構域的[1, 35]。Bach1 和 Bach2 作為用于具有功能性 NF-E2 位點的啟調節(jié)因子，也可以抑制成纖維細胞的基因轉錄。與已知 CNC 家族蛋白作用不同，Bach 蛋白的轉錄阻遏活性是獨特的[36, 37]。Bach 家族成員的結構和功能特點參與 MafK 的調控網(wǎng)絡。因此，它們可以通過與小結合發(fā)揮轉錄激活或轉錄抑制的作用[38, 39]�？傊�，Bach 蛋白通過亮氨afK 或其他的 bZIP 蛋白形成異源二聚體結合到 DNA 上 TRE 或 NF-E2ach 蛋白還可以通過其 BTB 結構域與其他的蛋白相互作用[1, 40]（圖 1

圖 1.2 Bach1 和小 Maf 異源二聚體的功能[12]Fig.1.2 BACH1/small Maf heterodimer and its function[12]值得注意的是，，為了研究參與 Bach1 在細胞代謝、氧化應激反應和細胞周期調控網(wǎng)絡的先子，Warnatz 及其同事報道了一個獨特的平臺。他們使用三種不同的小干擾 RNA 在 HEK細胞中敲低 Bach1 表達，然后進行染色質免疫沉淀測序分析（ChIP-seq）。敲低 Bach1 后，們通過 ChIP-seq 發(fā)現(xiàn)了 59 個靶基因參與細胞功能的調控[5]（表 1.2）。表 1.2 Bach1 下游基因及功能1.2.2 Bach1 與血管生成Cellular processes Bach1 target genesHeme degradation HMOX1, FTL, FTH1, ME1, SLC48A1Redox regulation GCLC,GCLM, SLC7A11Cell cycle and apoptosis pathways ITPR2, CALM1, TFE3, EWSR1, CDK6, BCL2L11Subcellular transport processes CLSTN1, PSAP, MAPT, vault RNA
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R739.4

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本文編號：2608927