【摘要】：[研究背景]帕金森病(Parkinson's disease,PD)作為第二大神經(jīng)退行性疾病,發(fā)病率逐年遞增,PD的主要病理特征為中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元的進(jìn)行性喪失,以及在損傷神經(jīng)元出現(xiàn)以α-突觸核蛋白(α-synuclein)為主要成分的路易小體(Lewy body)的聚集。PD的發(fā)病機(jī)制至今尚不明確,許多研究證明PD是一種多因素共同作用所導(dǎo)致的綜合性疾病。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)紊亂與線粒體功能障礙在PD的病程進(jìn)展中發(fā)揮著十分重要的作用。E3泛素連接酶TRIM31(Tripartite motif-containing protein 31)在細(xì)胞內(nèi)主要定位于線粒體,屬于具有泛素連接酶活性的TRIM家族,可對(duì)特定的靶分子進(jìn)行泛素化修飾和降解,參與細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育、抗病毒、癌變和凋亡等多種細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程。已有研究表明TRIM31與癌癥和炎性疾病有關(guān),然而TRIM31是否參與到PD的病理進(jìn)程目前還沒(méi)有報(bào)道。最近研究發(fā)現(xiàn),在抗病毒天然免疫中,TRIM31可以通過(guò)其E3泛素連接酶活性對(duì)MAVS進(jìn)行K63位泛素化修飾使其活化,從而促進(jìn)IFN-β的產(chǎn)生。而IFN-β被證實(shí)在多巴胺能神經(jīng)元的正常功能和存活中發(fā)揮著十分重要的作用,IFN-β缺失的小鼠會(huì)自發(fā)的出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)失調(diào)和學(xué)習(xí)認(rèn)知障礙。因此,本論文將探討TRIM31對(duì)PD的作用及其初步機(jī)制。[研究目的]本課題利用6-OHDA、MPTP化學(xué)刺激誘導(dǎo)PD模型,探討TRIM31在PD中的作用及機(jī)制。[研究方法]1.探究TRIM31缺失對(duì)小鼠的影響1.1通過(guò)水迷宮和Rota-rod行為學(xué)檢測(cè)不同年齡段TRIM31基因敲除(TRIM31-/-)小鼠運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力及學(xué)習(xí)記憶能力的改變。1.2電鏡觀察2、4、6個(gè)月TRIM31-/-小鼠黑質(zhì)線粒體形態(tài)學(xué)變化。2.確定TRIM31在PD模型后的表達(dá)及其細(xì)胞定位。2.1使用6-OHDA、MPTP建立小鼠PD模型,于造模后不同時(shí)間取小鼠黑質(zhì)及紋狀體組織,利用Western blot、Immunohistochemical檢測(cè)模型成功情況,Western blot檢測(cè)TRIM31蛋白水平。2.2免疫熒光法檢測(cè)TRIM31在黑質(zhì)中與小膠質(zhì)細(xì)胞,星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的共定位情況。2.3體外培養(yǎng)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株SH-SY5Y細(xì)胞,使用MPP+、6-OHDA刺激建立體外PD模型,于給藥后24h收取細(xì)胞,檢測(cè)TRIM31在細(xì)胞中蛋白水平的改變。2.4通過(guò)免疫熒光染色法,檢測(cè)TRIM31在線粒體的分布。3.確定TRIM31在PD模型中的作用3.1使用MPTP、6-OHDA分別在野生型以及TRIM31-/-小鼠中建立PD模型,檢測(cè)兩種基因型小鼠行為學(xué)評(píng)分以及模型后生存率情況。3.2 Western blot和Immunohistochemical檢測(cè)模型后兩種基因型小鼠TH蛋白水平及TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目變化。4.探討TRIM31對(duì)MPTP、6-OHDA誘導(dǎo)的PD模型的調(diào)控作用及機(jī)制。4.1 Real-time PCR檢測(cè)IFN-β、IL-1β的mRNA水平。4.2 Real-time PCR檢測(cè)線粒體DNA缺失率。4.3Western blot檢測(cè)線粒體穩(wěn)態(tài)相關(guān)蛋白,過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活劑1α(PGC1α)、線粒體融合蛋白2(MFN2)和視神經(jīng)萎縮蛋白1(OPA1)蛋白水平變化。[研究結(jié)果]1.對(duì)TRIM31-/-小鼠進(jìn)行行為學(xué)評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn),4月齡的TRIM31-/-小鼠較野生型小鼠運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力明顯減退,在6月齡記憶能力開(kāi)始出現(xiàn)顯著性差異。并且電鏡觀察到4、6月齡TRIM3N31-/-小鼠黑質(zhì)部位線粒體形態(tài)學(xué)的損傷,表現(xiàn)出線粒體腫脹、空泡化和線粒體嵴的斷裂和消失。2.TRIM31在小鼠腦內(nèi)尤其是黑質(zhì)紋狀體中有較高表達(dá)。在MPTP和6-OHDA誘導(dǎo)的小鼠PD模型中TRIM31蛋白表達(dá)明顯升高。3.免疫熒光染色顯示TRIM31的表達(dá)升高主要發(fā)生在黑質(zhì)的神經(jīng)元細(xì)胞中;在6-OHDA誘導(dǎo)的PD模型,小膠質(zhì)細(xì)胞中TRIM31也有明顯上調(diào);星形膠質(zhì)細(xì)胞中較少出現(xiàn)。4.在體外培養(yǎng)的SH-SY5Y中,MPP+、6-OHDA刺激后同樣觀察到了TRIM31的上調(diào),激光共聚焦顯示TRIM31主要定位于線粒體,并且MPP+、6-OHDA刺激可以促進(jìn)TRIM31向線粒體轉(zhuǎn)位。5.TRIM31基因缺失明顯加重了MPTP和6-OHDA誘導(dǎo)的PD模型中小鼠的黑質(zhì)紋狀體DA能神經(jīng)元損傷和運(yùn)動(dòng)能力障礙,TH蛋白水平以及THp陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)目顯著下降,TRIM31-/-小鼠與野生型小鼠相比在MPTP模型中存活率降低25%,在6-OHDA中存活率降低27%。6.在MPTP和6-OHDA誘導(dǎo)的小鼠PD模型中,野生型小鼠中黑質(zhì)IFN-β的mRNA水平明顯升高,TRIM31-/-小鼠中IFN-β的升高明顯被抑制。在體外培養(yǎng)的SH-SY5Y中,雖然MPP+刺激沒(méi)能引起IFN-β的升高,TRIM31的敲除顯著降低了IFN-β的mRNA水平。7.在MPTP和6-OHDA誘導(dǎo)的小鼠PD模型中,TRIM31基因的缺失明顯加重了MPTP和6-OHDA所致的PGC1α和OPA1蛋白水平的降低,但MFN2蛋白水平在兩種基因型小鼠模型前后并無(wú)明顯變化。TRIM31-/-小鼠在正常狀態(tài)下即出現(xiàn)線粒體DNA缺失率增加的現(xiàn)象,在模型后TRIM31-/-小鼠與野生型小鼠相比,缺失率并未出現(xiàn)差異。[研究結(jié)論]在6-OHDA和MPTP誘導(dǎo)的PD模型中,TRIM31可以通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體穩(wěn)態(tài)及IFN-β水平保護(hù)DA能神經(jīng)元,在PD中發(fā)揮著保護(hù)作用。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R742.5

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本文編號(hào)：2608479