發(fā)布時間：2020-03-30 13:42

【摘要】：作為細胞內(nèi)主要的蛋白質(zhì)降解途徑,泛素蛋白酶系統(tǒng)(UbiquitinProteasome System,UPS)包括26S蛋白酶體、去泛素化酶(Deubiquitinase,DUBs)'泛素分子、泛素活化酶E1、泛素結(jié)合酶E2和泛素連接酶E3。DUBs是一組能夠水解泛素羧基端的酯鍵、肽鍵和異肽鍵并將泛素分子從蛋白質(zhì)上移除的蛋白酶家族。泛素竣基端水解酶 L5(Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase isozyme L5,UCH-L5)是去泛素化酶家族成員之一。UCH-L5通過從多聚泛素鏈的遠端亞基逐個去除泛素分子,對于蛋白降解的調(diào)節(jié)具有雙重性,一方面通過移除標記蛋白的泛素分子從而抑制蛋白降解;另一方面通過適當移除泛素分子從而使得被泛素標記的蛋白具有有利于進入蛋白酶體的構(gòu)象從而促進蛋白質(zhì)的降解。當UCH-L5結(jié)合蛋白酶體19S調(diào)節(jié)亞基的Rpn13/Admr1受體時,UCH-L5活性增強;當UCH-L5與INO80復合物的NFRKB亞基結(jié)合時,其活性受到抑制。但是UCH-L5在腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及機制尚不清楚。本研究對19例冷凍和51例石蠟包埋的臨床病理切片進行分析,結(jié)果表明與正常腦組織相比,UCH-L5在腦膠質(zhì)瘤組織中呈低表達。在體外實驗中,UCH-L5可抑制膠質(zhì)瘤細胞系U87MG、U251細胞的遷移和侵襲功能。我們選擇SNRPN,SNRPF和CKLF作為UCH-L5的靶向候選基因,該三種基因已被證明在膠質(zhì)瘤或其他腫瘤中異常表達。我們發(fā)現(xiàn),干擾SNRPF,SNRPN或CKLF的表達可抑制U87MG細胞的遷移和侵襲能力;而干擾UCH-L5的表達可上調(diào)SNRPF的mRNA和蛋白水平,并且UCH-L5調(diào)節(jié)SNRPF在遷移和侵襲的功能在U87MG細胞得到了進一步證實,隨后在293T細胞中證實UCH-L5過表達可以下調(diào)SNRPF蛋白水平,因此本研究認為UCH-L5通過下調(diào)SNRPF從而抑制膠質(zhì)瘤細胞系的遷移和侵襲功能。同時,我們也發(fā)現(xiàn)UCH-L5可以下調(diào)包括SNRPF等8種基因在內(nèi)的Sm家族的mRNA水平表達。UCH-L5的活性受NFRKB調(diào)節(jié),我們發(fā)現(xiàn)在U87MG和U251 細胞中,NFRKB-siRNA 影響 UCH-L5 和 SNRPF 的 mRNA 水平,NFRKB-siRNA下調(diào)SNRPF的mRNA水平,因此我們推測,UCH-L5調(diào)節(jié)SNRPF的mRNA的表達可能受到NFRKB的調(diào)節(jié)。目前UCH-L5在膠質(zhì)瘤發(fā)生中的具體作用和調(diào)節(jié)機制尚未完全闡明,因此,進一步研究UCH-L5的生物學功能能夠為相關(guān)疾病的治療提供新的思路,具有重要的臨床意義。
【圖文】：

ｑＰＣＲ技術(shù)分析樣本中的ＵＣＨ－Ｌ５水平，３例正常腦組織和隨機選取的５例腦膠質(zhì)逡逑經(jīng)Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ技術(shù)分析ＵＣＨ－Ｌ５的蛋白水平。結(jié)果表明：與正常腦組織相比，，逡逑ＵＣＨ－Ｌ５的ｍＲＮＡ水平（圖３．１Ａ）和蛋白質(zhì)水平（圖３．１Ｂ）在腦肢質(zhì)瘤組織中水逡逑平較低。我們將４例正常腦組織和４７例膠質(zhì)瘤組織做成組織芯片（ＴＭＡ），進行逡逑免疫組化實驗，上述正常腦組織和腦膠質(zhì)瘤組織中ＵＣＨ－Ｌ５的表達差異經(jīng)免疫組逡逑化得到進一步證明（圖３．１Ｃ）。這些結(jié)果表明，腦組織中ＵＣＨ－Ｌ５低表達與膠質(zhì)瘤逡逑的發(fā)生呈正相關(guān)，但在低級別膠質(zhì)瘤和高級別膠質(zhì)瘤之間無差異（圖３．１Ｃ）。表１逡逑和表２顯示冷凍樣本和石蠟包埋樣品的詳細資料，包括數(shù)目、腫瘤級別、腫瘤類逡逑型和病人年齡。逡逑１４逡逑

病毒的感染效率經(jīng)檢測ＧＦＰ表達率證明均超過９０％。穩(wěn)定干擾和穩(wěn)定過表達逡逑ＵＣＨ－Ｌ５的單克隆細胞通過嘌呤霉素進行篩選得到并作為后續(xù)的實驗材料。慢病毒逡逑介導的穩(wěn)定干擾和過表達效率在Ｕ８７ＭＧ細胞中分別為７０％和２倍（圖３．８Ａ）。慢逡逑病毒介導的穩(wěn)定干擾和過表達效率在Ｕ２５１細胞中分別為６０％和３倍（圖３．８Ｂ）。逡逑相應地，我們發(fā)現(xiàn)ＵＣＨ－Ｌ５顯著抑制Ｕ８７ＭＧ細胞（圖３．８Ｃ和圖３．８Ｅ）和Ｕ２５１逡逑細胞（圖３．８Ｄ和圖３．８Ｆ）中ＳＮＲＰＦ的ｍＲＮＡ和蛋白水平的表達。逡逑２８逡逑
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R739.41

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本文編號：2607619