【摘要】：研究背景和目的:神經(jīng)母細(xì)胞瘤是兒童時期常見的顱外實體腫瘤,高�；純侯A(yù)后差,積極綜合治療長期存活率仍然較低,增加化療強度,并沒有顯著地改善高�；純旱拈L期生存狀況,而且大劑量的化療藥物可能會對患兒產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用。減少化療藥物劑量不能直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,但可誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)衰老而暫時抑制腫瘤細(xì)胞地惡性增殖,同時降低相關(guān)毒副作用。本實驗擬探討小劑量化療藥物順鉑是否能誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞衰老及其作用機制。研究方法:選擇NMYC基因擴增的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系(IMR32)為研究對象,利用噻唑藍(lán)比色法(MTT)和流式細(xì)胞術(shù)檢測不同濃度的順鉑對細(xì)胞生長和細(xì)胞周期的影響。利用顯微鏡觀察順鉑作用下細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化,并拍照記錄。利用用衰老相關(guān)-β-半乳糖苷酶(senescence associated-β-galactosidase,SA-β-gal)染色方法檢測細(xì)胞衰老情況。利用蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot)方法檢測衰老細(xì)胞內(nèi)NMYC及p-NMYC蛋白水平的表達(dá)情況。利用RT-PCR及Western Blot等技術(shù)研究與衰老相關(guān)分泌表型(senescence-associated sectroy phenotype,SASP)現(xiàn)象密切相關(guān)的IL-6/STAT3信號通路。結(jié)果:1、MTT結(jié)果提示不同濃度(0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L和5μmol/L)順鉑處理IMR32細(xì)胞后,24 h以內(nèi)各組細(xì)胞增殖速度無明顯差異。濃度為5μmol/L組在作用48 h后細(xì)胞增殖出現(xiàn)明顯抑制,72 h時表現(xiàn)更為明顯;2μmol/L組在48 h后細(xì)胞增殖速度明顯減緩,與0.5μmol/L組和1μmol/L組比較有顯著差異,72 h出現(xiàn)明顯增殖抑制;0.5μmol/L組對細(xì)胞增殖沒有明顯影響。2、流式細(xì)胞分析顯示不同濃度(0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L和5μmol/L)順鉑處理IMR32細(xì)胞48 h后,細(xì)胞周期在G2/M期的細(xì)胞分別占30.95%、57.58%、70.14%和38.69%,與對照組(G2/M期細(xì)胞占10.76%)比較有明顯差異。其中以濃度為2μmol/L組G2/M期阻滯率最高,占70.14%,同時凋亡檢測顯示細(xì)胞凋亡不明顯。而濃度為5μmol/L組阻滯率為38.69%,凋亡檢測顯示凋亡細(xì)胞明顯增多。3、小劑量順鉑(2μmol/L)作用于細(xì)胞24 h時,鏡下觀細(xì)胞形態(tài)改變不明顯,而作用48 h之后,顯微鏡下觀察可見細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化,與對照組相比,細(xì)胞數(shù)量減少,細(xì)胞體積明顯增大,沒有明顯細(xì)胞死亡。SA-β-gal衰老細(xì)胞染色可見給藥組藍(lán)染細(xì)胞數(shù)明顯多于對照組,說明小劑量順鉑在一定作用時間內(nèi)能夠誘導(dǎo)IMR32細(xì)胞出現(xiàn)衰老。4、收集順鉑(2μmol/L)作用不同時間段的細(xì)胞進(jìn)行Western Blot實驗,結(jié)果顯示藥物作用6 h和24 h時,與對照組相比,加藥組細(xì)胞內(nèi)NMYC及p-NMYC蛋白無明顯變化,隨著藥物作用時間延長,在作用48 h以后NMYC及p-NMYC蛋白呈現(xiàn)下降趨勢。5、與SASP相關(guān)的最突出的細(xì)胞因子是白細(xì)胞介素6(interleukin 6,IL-6),PCR實驗結(jié)果提示與對照組相比,在藥物作用24 h后細(xì)胞中IL-6 mRNA表達(dá)水平有所升高。結(jié)論:1、不同濃度順鉑可抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖,其中小劑量順鉑主要通過將細(xì)胞周期阻滯于G2/M期,而大劑量順鉑主要通過引起細(xì)胞凋亡而抑制腫瘤細(xì)胞增殖。2、小劑量順鉑可誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞出現(xiàn)衰老,進(jìn)而抑制腫瘤生長,而且NMYC蛋白在衰老的細(xì)胞中表達(dá)下調(diào),伴有IL-6 mRNA表達(dá)水平的升高。
【圖文】：

MR32 細(xì)胞增殖的影響 方法初步檢測不同濃度（0.5 μmol/L、1 μmol/L、2 μmo不同時間點（0 h、6 h、24 h、48 h 和 72 h）IMR32 細(xì)同濃度的順鉑作用于 IMR32 細(xì)胞 24 h 以內(nèi)細(xì)胞活力，不同濃度處理組的細(xì)胞生長曲線逐漸出現(xiàn)差異，以 5藥物作用時間的延長，其細(xì)胞增殖活力明顯受到抑制 細(xì)胞的增殖活力也具有抑制作用，其中作用 48 h 的 2 減緩，而且與 1 μmol/L 和 0.5 μmol/L 順鉑作用有顯著.01873），72 h 出現(xiàn)明顯增殖抑制作用。濃度為 0.5 μm，見圖 1。由此可見，順鉑濃度為 2 μmol/L 以上時，的增殖有明顯的抑制作用。

亡不明顯的情況下，對細(xì)胞的增殖有明顯的周期阻滯作用，而5 μmol/L組抑制細(xì)胞增殖的原因可能與誘導(dǎo)凋亡有關(guān)。圖2.A 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞周期； B 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡2.4.3 順鉑誘導(dǎo)IMR32細(xì)胞衰老的作用研究處于衰老狀態(tài)的細(xì)胞通常表現(xiàn)為細(xì)胞的體積變大呈現(xiàn)扁平狀態(tài)、細(xì)胞核膜內(nèi)陷、細(xì)胞器變形，并且表達(dá)在 PH 6.0 時有高酶活性的 β-半乳糖苷酶，催化底物 X-Gal 生成深藍(lán)色沉積產(chǎn)物[26]。為了檢測順鉑對 IMR32 細(xì)胞的衰老誘導(dǎo)效應(yīng)，，本研究根據(jù) MTT及流式細(xì)胞術(shù)的實驗結(jié)果確定了 2 μmol/L 為順鉑進(jìn)一步實驗的作用濃度，利用 2μmol/L 的順鉑處理 IMR32 細(xì)胞，觀察順鉑作用不同時間后細(xì)胞形態(tài)的改變，并且選擇作用 48 h 之后進(jìn)行細(xì)胞衰老相關(guān)-β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）試劑盒染色，觀察細(xì)胞衰老情況。藥物處理細(xì)胞后置于顯微鏡下觀察，并于 40 倍鏡頭下與對照組相比
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R739.4

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 溫玉琴;;研究發(fā)現(xiàn)成年神經(jīng)母細(xì)胞瘤的治療新靶點[J];廣東藥科大學(xué)學(xué)報;2019年05期

2 遲仁杰;王偉偉;劉銘;周顯軍;李富江;陳鑫;張桓瑜;董劏;鹿洪亭;;計算機輔助手術(shù)系統(tǒng)在小兒神經(jīng)母細(xì)胞瘤手術(shù)治療中的應(yīng)用[J];精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)雜志;2018年05期

3 董語迪;李志杰;;程序性壞死在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的研究進(jìn)展[J];中國小兒血液與腫瘤雜志;2017年01期

4 Mengling Liu;Yingfeng Xia;Jane Ding;Bingwei Ye;Erhu Zhao;Jeong-Hyeon Choi;Ahmet Alptekin;Chunhong Yan;Zheng Dong;Shuang Huang;Liqun Yang;Hongjuan Cui;查運紅;Han-Fei Ding;;轉(zhuǎn)錄分析顯示高危險的人類神經(jīng)母細(xì)胞瘤和小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤的球形細(xì)胞中有共同的代謝調(diào)節(jié)[J];科學(xué)新聞;2017年04期

5 陳麗英;王亞柱;鄒杰;張錦華;;小兒神經(jīng)母細(xì)胞瘤的診斷、分期與治療方案制定中影像檢查的作用[J];中國臨床醫(yī)學(xué)影像雜志;2017年10期

6 田永帥;陳鳳蓮;劉婕;鄒軍輝;萬曉春;趙琦;;神經(jīng)母細(xì)胞瘤免疫治療研究進(jìn)展[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2015年10期

7 李海峰;吳茂斌;蔣乃軍;劉媛;李敏;;腎上腺結(jié)節(jié)型節(jié)細(xì)胞神經(jīng)母細(xì)胞瘤1例報道及文獻(xiàn)復(fù)習(xí)[J];泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2015年06期

8 小卡;123RF;;絕癥不絕望:和寶寶并肩抗癌[J];健康之家;2017年06期

9 王煥民;;神經(jīng)母細(xì)胞瘤外科治療的技術(shù)與原則[J];中國小兒血液與腫瘤雜志;2014年01期

10 張惜妍;董理鳴;方玉靜;;神經(jīng)母細(xì)胞瘤患兒手術(shù)及術(shù)后化療的護理體會[J];山西醫(yī)藥雜志;2014年02期

相關(guān)會議論文 前10條

1 談?wù)?張勤;盛琦;何珂駿;張振興;袁曉軍;;神經(jīng)母細(xì)胞瘤高危組化療后外周血細(xì)胞改變及與感染相關(guān)因素的分析[A];第二十次全國兒科中西醫(yī)結(jié)合學(xué)術(shù)會議資料匯編[C];2016年

2 杝志峰;;治vB神經(jīng)母細(xì)胞瘤的近況和發(fā)展[A];第八屆全國兒童腫瘤學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2009年

3 金惠明;;有脊髓壓迫的嬰幼兒神經(jīng)母細(xì)胞瘤治療的挑戰(zhàn)與困惑[A];第八屆全國兒童腫瘤學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2009年

4 李杰;;不同強度化療方案對Ⅳ期神經(jīng)母細(xì)胞瘤患兒的治療價值[A];第八屆全國兒童腫瘤學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2009年

5 李曉玲;孫立榮;;血清神經(jīng)元特異性烯醇化酶對神經(jīng)母細(xì)胞瘤的診治價值[A];第八屆全國兒童腫瘤學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2009年

6 劉洲祿;陳迪祥;肖元宏;王政;蘇剛;劉貴麟;;67例神經(jīng)母細(xì)胞瘤外科手術(shù)方法體會[A];中華醫(yī)學(xué)會第八次全國小兒外科學(xué)術(shù)會論文集[C];2010年

7 王煥民;;神經(jīng)母細(xì)胞瘤的休眠和自然退化[A];中華醫(yī)學(xué)會第八次全國小兒外科學(xué)術(shù)會論文集[C];2010年

8 張曉倫;劉菁;包楠;;晚期神經(jīng)母細(xì)胞瘤的綜合治療[A];中華醫(yī)學(xué)會第八次全國小兒外科學(xué)術(shù)會論文集[C];2010年

9 楊翠微;高峰;馮建華;夏哲智;;小兒視性眼陣攣-肌陣攣綜合征伴神經(jīng)母細(xì)胞瘤:1例報道和文獻(xiàn)綜述[A];2011年浙江省醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會學(xué)術(shù)年會暨兒內(nèi)科疾病診治新進(jìn)展國家級學(xué)習(xí)班論文匯編[C];2011年

10 吳水華;肖雅玲;張雁冰;楊敏;周小漁;陳柏林;;干擾素-γ受體在神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)及與預(yù)后關(guān)系的研究[A];中華醫(yī)學(xué)會第十七次全國兒科學(xué)術(shù)大會論文匯編（下冊）[C];2012年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 魯亦;神經(jīng)母細(xì)胞瘤治療獲進(jìn)展[N];中國科學(xué)報;2019年

2 王欽 北京世紀(jì)壇醫(yī)院;兒童常見腫瘤癥狀早發(fā)現(xiàn)[N];中國中醫(yī)藥報;2017年

3 記者 王瀟雨 通訊員 歐曉芳;神經(jīng)母細(xì)胞瘤治療有新靶標(biāo)[N];健康報;2017年

4 葛素紅;我國首次完成——神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞原代培養(yǎng)[N];中國醫(yī)藥報;2002年

5 孟剛;早期診斷神經(jīng)母細(xì)胞瘤至關(guān)重要[N];中國消費者報;2007年

6 姚春雨 錢勇;解放軍總醫(yī)院開辟神經(jīng)母細(xì)胞瘤治療新途徑[N];中國醫(yī)藥報;2002年

7 上海中醫(yī)藥大學(xué)科技處;澳中研究團隊發(fā)現(xiàn)神經(jīng)母細(xì)胞瘤的致癌因子及治療靶點[N];上海中醫(yī)藥報;2019年

8 介生;血管生成抑制劑的表達(dá)可抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤生長[N];中國高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)導(dǎo)報;2001年

9 吳敏媛 孫媛;自體臍帶血移植治療神經(jīng)母細(xì)胞瘤等病有優(yōu)勢[N];中國醫(yī)藥報;2016年

10 中國婦女報·中國女網(wǎng)記者 高麗;惡性腫瘤成兒童死亡第二大原因[N];中國婦女報;2019年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 林孝坤;雷帕霉素凝膠注射劑對神經(jīng)母細(xì)胞瘤的作用研究[D];山東大學(xué);2019年

2 李圓;溶瘤病毒ZD55.F35-IL.24治療神經(jīng)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞的實驗研究[D];蘇州大學(xué);2018年

3 任傳濤;miR-25在小兒神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的作用及分子機制的研究[D];山東大學(xué);2018年

4 姜敏;神經(jīng)母細(xì)胞瘤中RHOB的作用及Perifosine處理后泛素化蛋白質(zhì)組學(xué)的研究[D];中國醫(yī)科大學(xué);2018年

5 程欣茹;miR-34a通過靶向抑制ATG5抑制小兒神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和自噬的機制研究[D];鄭州大學(xué);2019年

6 劉鵬;CASC15、LMO1基因單核苷酸多態(tài)性與兒童神經(jīng)母細(xì)胞瘤易感性的關(guān)聯(lián)研究[D];鄭州大學(xué);2019年

7 龐啟明;多種分子與生物標(biāo)記物對兒童神經(jīng)母細(xì)胞瘤早期診斷及預(yù)后評估意義[D];山東大學(xué);2019年

8 張敏;Legumain調(diào)節(jié)NB生物學(xué)特征的機制和靶向藥物的研究[D];上海交通大學(xué);2017年

9 李聃;腸凝集素1抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移的作用及機制研究[D];華中科技大學(xué);2017年

10 張焯榮;遺傳變異與神經(jīng)母細(xì)胞瘤易感性、預(yù)后關(guān)系的分子流行病學(xué)研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2017年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 夏寶佳;人參皂苷Rh2對神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y的生物學(xué)行為的影響[D];中國醫(yī)科大學(xué);2019年

2 王培培;兒童Ⅲ/Ⅳ期神經(jīng)母細(xì)胞瘤綜合治療及預(yù)后影響因素研究[D];中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院;2019年

3 遲仁杰;Asef調(diào)節(jié)神經(jīng)母細(xì)胞瘤中β-catenin的表達(dá)[D];青島大學(xué);2019年

4 田麗媛;S100A8和S100A9在神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞中增殖、遷移的作用及其機制的研究[D];青島大學(xué);2019年

5 司瑩瑩;不同濃度Am80對人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞增殖分化及化療耐藥的影響[D];青島大學(xué);2019年

6 孫君杰;順鉑誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞衰老及作用機制的實驗研究[D];華中科技大學(xué);2019年

7 李超群;拉曼光譜結(jié)合統(tǒng)計學(xué)分析神經(jīng)母細(xì)胞瘤及相關(guān)腫瘤成分的差異表達(dá)[D];華中科技大學(xué);2019年

8 彭妍;抑制GLUT1表達(dá)對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞糖代謝和生物學(xué)行為影響的研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2019年

9 陳書明;脫氧膽酸對神經(jīng)母瘤細(xì)胞SHSY-5Y的抑制作用及機理研究[D];廈門大學(xué);2018年

10 李勇;神經(jīng)母細(xì)胞瘤首次化療誘發(fā)重度骨髓抑制影響因素分析[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2018年

本文編號：2607224