【摘要】：膠質(zhì)瘤(glioma)是一種常見的顱內(nèi)原發(fā)腫瘤,占惡性腦腫瘤的80%,年發(fā)病率約為5/100,000,且預(yù)后很差。盡管目前診斷和治療技術(shù)都取得了很大的進步,但是膠質(zhì)瘤患者的生存率仍沒有顯著提高。近年來,隨著腫瘤遺傳學(xué)和測序技術(shù)的飛速發(fā)展,在膠質(zhì)瘤中發(fā)現(xiàn)了越來越多的重要遺傳學(xué)改變,其中異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase,IDH)突變被認(rèn)為是膠質(zhì)瘤最重要的遺傳學(xué)改變。IDH突變廣泛存在于膠質(zhì)瘤中,其中低級別膠質(zhì)瘤(lower-grade glioma,LGG)和繼發(fā)性膠質(zhì)母細胞瘤(secondary glioblastoma)的發(fā)生率高達80%以上,但是在原發(fā)性膠質(zhì)母細胞瘤(primary glioblastoma)中發(fā)生率僅為5%作用。突變型IDH能夠?qū)ⅵ?酮戊二酸(α-ketoglutarate,α-KG)轉(zhuǎn)化為D-2-羥戊二酸(D-2-hydroxyglutarate,D-2-HG),由于D-2-HG和α-KG結(jié)構(gòu)類似,可以競爭性地抑制α-KG依賴的雙加氧酶(dioxygenases),如組蛋白和DNA的去甲基化酶,導(dǎo)致腫瘤表觀遺傳學(xué)等發(fā)生改變。微血管增生(microvascular proliferation)是膠質(zhì)瘤重要特征之一,但是IDH突變膠質(zhì)瘤的血管結(jié)構(gòu)特點仍不明確。血管周細胞(pericytes)是構(gòu)成血腦屏障的重要組成部分,對維持血管正常功能極其重要。在膠質(zhì)瘤中,血管周細胞覆蓋的增加往往伴隨著較差的預(yù)后。作為淋巴管內(nèi)皮細胞的重要標(biāo)志,平足蛋白(podoplanin,Pdpn)在淋巴管和血管發(fā)育中具有重要的作用。在Pdpn敲除的小鼠中,小鼠表現(xiàn)出自發(fā)性出血,血管周細胞減少覆蓋并彌散分布在血管周邊。我們發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)瘤中,Pdpn在血管周圍高表達,并且Pdpn表達水平與膠質(zhì)瘤級別正相關(guān)。然而,Pdpn在膠質(zhì)瘤血管形成和增殖中的具體作用仍不清楚。本研究利用人膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本,分析IDH突變對膠質(zhì)瘤微血管結(jié)構(gòu)、血管周細胞覆蓋率以及Pdpn表達的影響。在裸鼠顱內(nèi)膠質(zhì)瘤模型中,確定了Pdpn表達與血管周細胞覆蓋之間的關(guān)系。利用膠質(zhì)細胞特異性突變型IDH1敲入小鼠,以及表達野生型和突變型IDH1的膠質(zhì)瘤細胞,探討野生型和突變型IDH1調(diào)節(jié)Pdpn表達的分子機制。1)IDH突變膠質(zhì)瘤中血管周細胞覆蓋降低首先,我們利用MRI檢測了膠質(zhì)瘤腦血流量(cerebral blood flow,CBF),結(jié)果發(fā)現(xiàn)IDH突變膠質(zhì)瘤的腦血流量明顯低于無IDH突變的膠質(zhì)瘤。通過免疫組化(immunohistochemistry,IHC)染色發(fā)現(xiàn),IDH突變膠質(zhì)瘤中CD34陽性微血管密度(microvascular density,MVD)與同類型無IDH突變膠質(zhì)瘤之間無顯著差異,但α-SMA陽性MVD顯著低于無IDH突變膠質(zhì)瘤。進一步IHC染色分析顯示,IDH突變膠質(zhì)瘤微血管NG2和PDGFR-β陽性細胞數(shù)量亦顯著減少。NG2、PDGFR-β和α-SMA均是微血管周細胞(pericytes)的標(biāo)志分子,因此提示IDH突變能夠減少膠質(zhì)瘤微血管中周細胞的覆蓋,從而影響微血管的結(jié)構(gòu)。2)IDH突變抑制膠質(zhì)瘤Pdpn表達減少血管周細胞覆蓋為了探討IDH突變膠質(zhì)瘤微血管結(jié)構(gòu)改變的機制,我們分析了TCGA數(shù)據(jù)庫中膠質(zhì)瘤mRNA差異,結(jié)果發(fā)現(xiàn)IDH突變膠質(zhì)瘤中Pdpn mRNA水平明顯減低,而且IHC染色、Western blot和定量PCR(quantitative PCR,qPCR)也提示了相同的結(jié)果。此外,IHC染色結(jié)果還顯示,IDH突變膠質(zhì)瘤中Pdpn顯著降低的同時,微血管NG2、PDGFR-β和α-SMA陽性周細胞覆蓋也顯著減少,且膠質(zhì)瘤Pdpn表達水平與α-SMA陽性MVD呈正相關(guān)。我們進一步建立了穩(wěn)定過表達Pdpn的U87和U251膠質(zhì)瘤細胞,體外研究發(fā)現(xiàn),Pdpn能夠促進膠質(zhì)瘤細胞遷移,但不影響細胞增殖。在體內(nèi),通過顱內(nèi)接種U87細胞建立裸鼠膠質(zhì)瘤移植模型,我們研究發(fā)現(xiàn),Pdpn過表達促進膠質(zhì)瘤細胞浸潤,增大腫瘤體積,并增加腫瘤中α-SMA和PDGFR-β陽性周細胞的數(shù)量�；谝陨涎芯�,我們建立了膠質(zhì)細胞特異性突變型IDH1敲入(IDH1~+/LSL-R132Q/LSL-R132Q GFAP-Cre)小鼠,發(fā)現(xiàn)新生小鼠腦組織有明顯的自發(fā)出血,通過HE染色和電鏡觀察發(fā)現(xiàn),在膠質(zhì)細胞敲入突變型IDH1能夠?qū)е挛⒀苤車g隙增大。免疫熒光提示,Pdpn在血管周圍的膠質(zhì)細胞中表達水平顯著較高。腦組織和原代膠質(zhì)細胞的Western blot和qPCR分析顯示,IDH突變能夠抑制膠質(zhì)細胞Pdpn表達,減少α-SMA陽性周細胞覆蓋。以上結(jié)果表明,IDH突變能夠下調(diào)膠質(zhì)瘤中Pdpn表達,抑制膠質(zhì)瘤血管周細胞的覆蓋。3)野生型IDH1促進膠質(zhì)瘤Pdpn表達正常腦組織內(nèi)Pdpn的表達水平很低,但無IDH突變膠質(zhì)瘤中Pdpn表達顯著升高。在本研究中,我們意外發(fā)現(xiàn),過表達野生型IDH1(wildtype IDH1,wtIDH1)能夠顯著增加U87和U251細胞中Pdpn的表達。進一步,我們發(fā)現(xiàn),在無IDH突變的膠質(zhì)瘤中Pdpn與IDH1 mRNA含量正相關(guān)。同時,總IDH1 mRNA含量隨著膠質(zhì)瘤級別升高而升高,且與IDH1是否突變無關(guān)。Western blot和IHC染色也顯示,IDH1表達水平在膠質(zhì)母細胞瘤中均顯著升高,并與IDH是否突變無關(guān)。此外,我們發(fā)現(xiàn)IDH1敲除(IDH1~(LSL/LSL))小鼠腦組織和原代膠質(zhì)細胞中Pdpn表達均有降低。這些結(jié)果提示,在無IDH突變膠質(zhì)瘤中,野生型IDH1升高是促進Pdpn表達的重要原因。4)野生和突變型IDH1共同調(diào)控Pdpn基因啟動子甲基化為了確定IDH1如何調(diào)控膠質(zhì)瘤Pdpn的表達,我們在膠質(zhì)瘤U251和U87分別過表達wtIDH1和/或突變型IDH1(mutant IDH1,muIDH1)。Western blot和qPCR顯示,過表達wtIDH1能夠顯著增加膠質(zhì)瘤細胞中Pdpn的表達,且muIDH1能夠抑制由wtIDH1誘導(dǎo)的Pdpn高表達。進一步,利用熒光素酶報告系統(tǒng),我們發(fā)現(xiàn)wtIDH1能夠增加Pdpn基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性,且muIDH1能夠抑制由wtIDH1誘導(dǎo)的Pdpn基因啟動子的高轉(zhuǎn)錄活性。此外,我們還發(fā)現(xiàn)Octyl-2-HG和D-2-HG也能夠抑制原代膠質(zhì)細胞和過表達wtIDH1的U251細胞中Pdpn的表達,且存在劑量依賴關(guān)系。熒光素酶報告系統(tǒng)也顯示,二者能夠抑制表達wtIDH1細胞中的Pdpn基因啟動子的高轉(zhuǎn)錄活性。很多研究顯示,啟動子的甲基化修飾參與了Pdpn的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,我們發(fā)現(xiàn)在IDH突變膠質(zhì)瘤中Pdpn基因啟動子CpG島甲基化水平顯著升高,而無IDH突變膠質(zhì)瘤中Pdpn啟動子甲基化水平顯著降低。在體外,過表達wtIDH1能夠顯著降低Pdpn啟動子的甲基化,而muIDH1卻導(dǎo)致Pdpn啟動子的高甲基化。由于wtIDH1并不產(chǎn)生D-2-HG,但能夠催化異檸檬酸(isocitrate)轉(zhuǎn)變?yōu)棣?KG,而α-KG是DNA去甲基化酶的共因子(co-factor)。定量分析發(fā)現(xiàn),在IDH突變的膠質(zhì)瘤中α-KG含量顯著降低,而且過表達wtIDH1能夠增加細胞內(nèi)α-KG含量,但muIDH1能夠降低膠質(zhì)(瘤)細胞中的α-KG含量。此外,Octyl-2-HG和D-2-HG能夠促進Pdpn啟動子的高甲基化。這些結(jié)果提示,野生型IDH1通過增加細胞內(nèi)α-KG水平,促進膠質(zhì)瘤中Pdpn啟動子的去甲基化,增加Pdpn表達,而突變型IDH1功能恰好相反。綜上所述,IDH突變能夠減少膠質(zhì)瘤內(nèi)α-KG水平,同時產(chǎn)生D-2-HG,其共同抑制α-KG依賴的雙加氧酶,導(dǎo)致Pdpn基因啟動子的高甲基化,降低膠質(zhì)瘤Pdpn表達。Pdpn能夠促進微血管中周細胞的覆蓋,因此在IDH突變膠質(zhì)瘤微血管中周細胞覆蓋減少,從而影響膠質(zhì)瘤的血管結(jié)構(gòu)。本研究探討了野生和突變型IDH1在膠質(zhì)瘤中的作用和相互關(guān)系,確定了Pdpn在膠質(zhì)瘤血管周細胞形成中的作用和調(diào)控機制。研究結(jié)果不僅有助于認(rèn)識腫瘤中血管周細胞的形成和調(diào)控機制,也為深入研究細胞內(nèi)關(guān)鍵代謝物在腫瘤的發(fā)生中的作用提供了實驗基礎(chǔ)。
【圖文】：

空軍軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文D-2-hydroxyglutarate，2-HG）。盡管哺乳動物細胞在正常情況下也會產(chǎn)生一定量的L-2-HG，但產(chǎn)生的D或L-2-HG會被相應(yīng)的2-HG脫氫酶（2-HG dehydrogenases）化為α-KG。在IDH突變的膠質(zhì)瘤細胞中，D-2-HG濃度可以達到5-35μmol/g組織，均濃度為15.48μmol/g組織[7]。由于D-2-HG結(jié)構(gòu)與α-KG類似，能夠阻斷α-KG依賴的促反應(yīng)。因此，D-2-HG被稱為癌代謝物（oncometabolite），然而也有研究報道認(rèn)D-2-HG能夠用于某些腫瘤的治療[8]。目前，IDH突變在腫瘤發(fā)生和發(fā)展的作用及制仍需要廣泛的研究和探討。

86%的 IDH 突變及 1p/19q 無缺失的患者有 ATRX 突變[66, 68, 69]，且 AT變似乎和 TERT 啟動子互相排斥[67]。在較低級別星形膠質(zhì)瘤中大概有 83%的 TP變，并且 TP53 突變經(jīng)常伴隨著 IDH 突變，但缺乏 1p/19q 缺失[69]。綜合上述腫瘤分子標(biāo)志物特點，膠質(zhì)瘤可以分為以下 3 種分子亞型：1）IDH伴隨 1p/19q 缺失和 TERT 啟動子突變，主要包括少突膠質(zhì)瘤的病理分型；2）ID變無 1p/19q 缺失，但常伴隨 TP53 和 ATRX 突變，主要為星形細胞瘤（WHO II-I病理分型；3）IDH 野生型伴隨 TERT 啟動子突變，其以膠質(zhì)母細胞瘤（WHO I主。有意思的是，分子分型比組織病理分級能更好的預(yù)測膠質(zhì)瘤臨床特征。因此界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分型同時了組織病理診斷和分子診斷，用 IDH 突變和 1p/19q 缺失來創(chuàng)建一個綜合性病理標(biāo)準(zhǔn)。另外，雖然分子診斷有助于形成一個完整的病理，但按 WHO 標(biāo)準(zhǔn)分類，P53 和 ATRX 突變等分析不是必需的[70]。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R739.41

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 楊海霞;李曉鳴;;外泌體與膠質(zhì)瘤關(guān)系的研究進展[J];臨床與病理雜志;2017年11期

2 秦麗娟;賈永森;趙喜慶;張?zhí)?張偉;孫娜;;鴉膽子油乳注射液對膠質(zhì)瘤細胞侵襲性的影響及其可能機制[J];四川大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2016年03期

3 齊玲;徐俊杰;紀(jì)朋艷;呂士杰;韓磊;王瑋瑤;;西蘭花多肽抑制膠質(zhì)瘤細胞生長的機制研究[J];中國藥學(xué)雜志;2014年12期

4 萬政強;陳晨;伏林山;孫關(guān);;吡格列酮對膠質(zhì)瘤細胞生長的抑制研究[J];東南大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2013年01期

5 李嗍,王楓,繆珊,駱文靜;過量鋅對鼠膠質(zhì)瘤細胞體外生長的影響[J];解放軍預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志;2001年04期

6 楊偉廉,王堯,韋永新,阮長耿,杜子威;抗膠質(zhì)瘤細胞單克隆抗體SZ-38及其識別抗原的生化特征[J];生物化學(xué)雜志;1988年06期

7 斯可哉;;在體外和體內(nèi)用利血平調(diào)節(jié)C_6膠質(zhì)瘤細胞亞系對ACNU的抗藥性[J];國外醫(yī)學(xué)(腫瘤學(xué)分冊);1988年02期

8 楊偉廉;抗膠質(zhì)瘤細胞單克隆抗體SZ—38及其識別抗原的生化特征[J];蘇州醫(yī)學(xué)院學(xué)報;1989年01期

9 李方園;高翼之;王世浚;;四種人癌基因在腦瘤中的擴增和重排(摘要)[J];鐵道醫(yī)學(xué);1989年01期

10 李明偉;唐文淵;;影響膠質(zhì)瘤化療效果的一些因素及其對策[J];國外醫(yī)學(xué).神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科學(xué)分冊;1989年04期

相關(guān)會議論文 前10條

1 楊鵬宇;李強;張建生;;雷帕霉素聯(lián)合尼莫司汀抑制膠質(zhì)瘤細胞的研究[A];2011中華醫(yī)學(xué)會神經(jīng)外科學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2011年

2 俞文華;車志豪;張祖勇;許培源;陸鏞民;傅林;朱強;陳鋒;杜權(quán);;骨橋蛋白在膠質(zhì)瘤細胞中的表達及其信號傳導(dǎo)途徑[A];2005年浙江省神經(jīng)外科學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2005年

3 潘冬生;;多基因修飾膠質(zhì)瘤細胞疫苗的抗腫瘤免疫反應(yīng)[A];中國醫(yī)師協(xié)會神經(jīng)外科醫(yī)師分會第六屆全國代表大會論文匯編[C];2011年

4 張玉寶;孫金龍;孟祥靖;魏麟;劉廣存;崔友強;;膠質(zhì)瘤細胞中VEGF、MMP-2、MMP-9的表達及臨床觀察[A];中華醫(yī)學(xué)會神經(jīng)外科學(xué)分會第九次學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2010年

5 趙世光;;膠質(zhì)瘤細胞周期動力學(xué)研究[A];中國醫(yī)師協(xié)會神經(jīng)外科醫(yī)師分會成立大會資料匯編[C];2004年

6 張瑞;胡佩珊;臧清策;岳小飛;周幟;徐曉宇;韓為;張瑞萍;再帕爾·阿不力孜;;基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的膠質(zhì)瘤細胞代謝組學(xué)分析[A];中國化學(xué)會第十一屆全國生物醫(yī)藥色譜及相關(guān)技術(shù)學(xué)術(shù)交流會（大會特邀報告及墻報）論文摘要集[C];2016年

7 宋楊英;劉英姿;單保恩;;IL-18基因轉(zhuǎn)染對大鼠9L膠質(zhì)瘤細胞生長特性的影響[A];中華醫(yī)學(xué)會第九次全國檢驗醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會議暨中國醫(yī)院協(xié)會臨床檢驗管理專業(yè)委員會第六屆全國臨床檢驗實驗室管理學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2011年

8 楊孔賓;趙世光;劉炳學(xué);陳曉豐;戴欽舜;;K~+通道阻斷劑四乙胺對大鼠膠質(zhì)瘤細胞的增殖和凋亡影響[A];中國醫(yī)師協(xié)會神經(jīng)外科醫(yī)師分會第四屆全國代表大會論文匯編[C];2009年

9 李格;黃益玲;;MiR-19a靶向LRIG1對腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的影響[A];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)會第十二屆全國會員代表大會暨2018年全國學(xué)術(shù)會議摘要集[C];2018年

10 李子超;姜東伯;楊舒雅;王靜;孫元杰;趙國慶;楊琨;;B細胞受體相關(guān)蛋白31對膠質(zhì)瘤細胞行為的影響[A];第十一屆全國免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會摘要匯編[C];2016年

相關(guān)重要報紙文章 前2條

1 特約記者 李岳冰;中國膠質(zhì)瘤放療專家共識發(fā)布[N];健康報;2018年

2 張獻懷　張文;瘤區(qū)埋雷 持續(xù)殺傷[N];健康報;2007年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 李俠;JMJD3在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及機制研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2017年

2 孫超;IDH1突變抑制膠質(zhì)瘤Podoplanin表達調(diào)控血管周細胞覆蓋的研究[D];中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué);2018年

3 肖瑾;多模態(tài)MRI在人腦膠質(zhì)瘤病理分級、基因型及其預(yù)后評估中的應(yīng)用[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2018年

4 尤昕;Nexilin表達下調(diào)對膠質(zhì)瘤細胞生物學(xué)特性的影響及機制研究[D];延邊大學(xué);2015年

5 鄧鑫;HAX-1蛋白通過Akt1通路對膠質(zhì)瘤細胞增殖和調(diào)亡的影響及機制研究[D];鄭州大學(xué);2018年

6 唐純海;miR-130a調(diào)控靶基因HMGB2抑制膠質(zhì)瘤增殖和EMT的分子機制研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2018年

7 孫瑾;MiR-152-3p靶向調(diào)控DNMT1-NF2通路與膠質(zhì)瘤細胞凋亡、侵襲機制的研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2018年

8 盧鳳飛;miR-497/Wnt3a/c-jun反饋環(huán)路調(diào)控神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞生長和上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化的分子機制研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2018年

9 李峰;阻斷CD47-SIRPα信號通路對膠質(zhì)瘤細胞/膠質(zhì)瘤干細胞的靶向治療研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2018年

10 王向鵬;膠質(zhì)瘤相關(guān)lncRNA表達譜分析以及PAR5在膠質(zhì)瘤中的功能和機制研究[D];昆明醫(yī)科大學(xué);2018年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 黨瑩;異甘草素對SHG44膠質(zhì)瘤干細胞侵襲和遷移的影響[D];甘肅中醫(yī)藥大學(xué);2018年

2 張旭浩;含有膠質(zhì)瘤干細胞裂解物的新型膠質(zhì)瘤疫苗在小鼠顱內(nèi)原位膠質(zhì)瘤模型中的效力評價[D];吉林大學(xué);2016年

3 徐蒙萊;IVIM-DWI和DKI對膠質(zhì)瘤病理分級的診斷價值[D];南京醫(yī)科大學(xué);2016年

4 周燕晴;SHCBP1過表達對膠質(zhì)瘤遷移及侵襲的作用機制和臨床應(yīng)用初探[D];廣東藥科大學(xué);2018年

5 俞天賦;EZH2抑制劑GSK343對膠質(zhì)瘤細胞的影響及機制研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2016年

6 胡奇;H19內(nèi)源性競爭miR-130a-3p調(diào)控S0X4影響膠質(zhì)瘤EMT進程的機制研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2016年

7 李杰;KPNA2通過調(diào)節(jié)c-myc促進膠質(zhì)瘤糖酵解代謝重編程的研究[D];山東大學(xué);2018年

8 張超奇;PD-L1在膠質(zhì)瘤中表達的臨床意義及相關(guān)機制研究[D];鄭州大學(xué);2018年

9 雷舒婷;穩(wěn)定表達EGFRvⅢ膠質(zhì)瘤細胞株的建立[D];鄭州大學(xué);2018年

10 張學(xué)文;基于iPDMS的多肽微陣列技術(shù)在膠質(zhì)瘤患者血清GFAP自身抗體篩查中的應(yīng)用[D];蘇州大學(xué);2018年

，

本文編號：2606662