【摘要】：遺傳性小腦共濟失調(diào)是一類異質性疾病,其主要特征為:共濟失調(diào)、特殊面容、小腦萎縮并伴隨著神經(jīng)退行病變。小腦共濟失調(diào)疾病的一個共同病理特征是由浦肯野細胞缺失引起的漸進性小腦退行性病變。該疾病包括脊髓小腦性共濟失調(diào)、弗里德賴希共濟失調(diào)和共濟失調(diào)毛細血管擴張癥等,發(fā)病率為8.9/10萬人。遺傳性小腦共濟失調(diào)除了包括三核甘酸重復以致未折疊有毒蛋白積累的顯性遺傳疾病外,還包括由特定基因失活突變引起的早發(fā)性隱性遺傳疾病。有報道編碼分選蛋白Sorting nexin 14(SNX14)的SNX14基因突變后引起常染色體隱性脊髓小腦性共濟失調(diào)并伴有小腦浦肯野細胞的缺失,但由于缺乏整體動物的研究,我們對SNX14突變導致該疾病的分子機制依然未知。SNX14屬于sorting nexin家族成員,主要在細胞膜泡運輸、信號傳導中起重要作用。為了進一步探索SNX14在小腦和浦肯野細胞的細胞分子功能,我們構建了在全腦和小腦浦肯野細胞Snx14條件性敲除小鼠,并對這些小鼠進行一系列表型和機制的研究。結果發(fā)現(xiàn),Snx14全腦敲除小鼠的運動能力有嚴重缺陷,病理檢查發(fā)現(xiàn)該品系小鼠小腦的整體形態(tài)無明顯改變,但小腦中浦肯野細胞出現(xiàn)了大量的缺失,并隨年齡增加有加重的趨勢。同時,,Snx14浦肯野細胞特異性敲除小鼠也表現(xiàn)出了類似的運動障礙和浦肯野細胞缺失,提示Snx14全腦敲除小鼠的病理表型是由浦肯野細胞自主性死亡引起的。接下來,我們用透射電鏡觀察到Snx14條件性敲除小鼠的浦肯野細胞線粒體形態(tài)異常、電子密度增大且顆粒變小。作為一種分選蛋白,SNX14可能通過與貨物蛋白的相互作用而發(fā)揮運輸功能,因此我們用LS-MS質譜分析技術找到了一些與SNX14相互作用的蛋白,其中包括一些已知與小腦脊髓性共濟失調(diào)密切相關的分子,如AMPD2、CTND2和VPP1。我們猜測SNX14缺失可能影響了與其相互作用的蛋白的生物功能,進而導致浦肯野細胞的退化缺失和共濟失調(diào)的表型。另一方面,我們在Hela細胞中觀察到SNX14與溶酶體的標志物有共定位。綜上所述,我們通過實驗證明了 SNX14缺失直接導致了浦肯野細胞的退化缺失,這很可能是小鼠出現(xiàn)小腦共濟失調(diào)的重要原因。另外,我們找到了一些SNX14的關鍵相互作用蛋白,這為后續(xù)深入的機制研究提供思路。同時,也為治療藥物的研發(fā)提供了重要的動物模型工具。
【圖文】：

＜ＳｉＶ幻４在疾病發(fā)展中及小腦組織中的作用，我們與賽業(yè)公司合作使用ＫＯ邋Ｆｉｒｓｔ逡逑的技術構建了邐以條件性基因敲除小鼠，特異性敲除鼠源ＭＭ基因的第９－１２逡逑號外顯子區(qū)域（圖３．１Ａ），因為該段是小腦脊髓共濟失調(diào)患者５７ＶＺ以突變的高發(fā)逡逑區(qū)。將得到的＊Ｓ＞ｉｘｉ４ｙＺｏｘ小鼠分別與Ｎｅｓｔｉｎ－ｃｒｅ和Ｐｃｐ２－ｃｒｅ邋（購自南方模式動物逡逑公司）轉基因小鼠交配，得到分別在全腦及浦肯野細胞中特異性敲除的小逡逑鼠。逡逑在得到敲除小鼠后，我們首先對三種不同基因型的小鼠：野生型（ＷＴ）、雜逡逑合子（Ｎｅｓｔｉｎ－ｃｒｅ；５＞ｕ：７嚴）和純合敲除小鼠（Ｎｅｓｔｉｎ－ｃｒｅ；＊Ｓ＞ｉｘｉ產(chǎn)）進行了基因型逡逑鑒定，證明基因己被敲除（圖３．１Ｂ）。其次在蛋白水平上，Ｎｅｓｔｉｎ－ｃｒｅ＾Ｗ＃逡逑小鼠在小腦、皮層和海馬均未檢測到ＳＮＸ１４蛋白表達，而在肝臟、肺和脾等外逡逑周臟器中則有正常表達，，提示ＳＮＸ１４在中樞特異性敲除（圖３．１Ｃ）。逡逑３６逡逑

齡的邋Ｎｅｓｔｉｎ－ｃＫＯ邋小鼠（Ｎｅｓｔｉｎ－ｃｒｅ；＜Ｓｎｘ７＃）與對照小鼠（５＞認／４／／＋、氣逡逑Ｎｅｓｔｉｎ－ｃｒｅ；１Ｓ１ｎｘｉ４／／＋）在行動步態(tài)與綜合運動能力上的差異。在足跡實驗中，我們逡逑發(fā)現(xiàn)一個月齡的Ｎｅｓｔｉｎ－ｃｒｅ沒ｗＪ＃小鼠步態(tài)散亂（圖３．２），在準確測量步長距離逡逑（ｓｔｒｉｄｅ邋ｌｅｎｇｔｈ）和同掌之間的步間距離（ｏｖｅｒｌａｐ邋ｌｅｎｇｔｈ）后發(fā)現(xiàn)邋Ｎｅｓｔｉｎ－ｃｒｅ；５＞ｕ：／戶ｆ逡逑小鼠步長要略短于對照小鼠（圖３．３Ａ），并且同掌之間的前后肢的距離也要比對逡逑照小鼠更寬（圖３．３Ｂ），說明Ｎｅｓｔｉｎ－ｃｒｅ；１Ｓ？ｘ７／0Ｊ、鼠行動步態(tài)在敲除后受到逡逑了影響。在轉棒實驗中，我們發(fā)現(xiàn)在測試的第三天，Ｎｅｓｔｉｎ－ｃｒｅ；＜Ｓ＞ｚｘ７／〃相比于對逡逑照小鼠會更早的從轉棒上掉落（圖３．３Ｃ），說明Ｎｅｓｔｉｎ－ｃｒｅＪ／ｕｃｉ／ｉ小鼠在逡逑敲除后運動協(xié)調(diào)能力明顯下降。逡逑接下來，我們又用同樣的行為學范式測試了兩個月齡的Ｎｅｓｔｉｎ－ｃｒｅｆｗｃｉ，逡逑小鼠與對照小鼠（５＞２；＜：７４＃＋、和Ｎｅｓｔｉｎ－ｃｒｅ；＜ＳＷｊｃｉ＜／／＋）在行動步態(tài)與綜合運逡逑動能力上的差異。在足跡實驗中，我們發(fā)現(xiàn)兩個月齡的Ｎｅｓｔｉｎ－ｃｒｅ加；鼠步逡逑長明顯比對照小鼠更短（圖３．４Ａ），步間距也更寬（圖３．４Ｂ），這提示隨著小鼠逡逑年齡的增加
【學位授予單位】：廈門大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R744.7

【參考文獻】

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1 馬秀娥;崔映宇;陳義漢;;分選鏈接蛋白家族研究進展[J];科學通報;2014年35期

本文編號：2604350