【摘要】：遺傳性小腦共濟(jì)失調(diào)是一類異質(zhì)性疾病,其主要特征為:共濟(jì)失調(diào)、特殊面容、小腦萎縮并伴隨著神經(jīng)退行病變。小腦共濟(jì)失調(diào)疾病的一個(gè)共同病理特征是由浦肯野細(xì)胞缺失引起的漸進(jìn)性小腦退行性病變。該疾病包括脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)、弗里德賴希共濟(jì)失調(diào)和共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張癥等,發(fā)病率為8.9/10萬人。遺傳性小腦共濟(jì)失調(diào)除了包括三核甘酸重復(fù)以致未折疊有毒蛋白積累的顯性遺傳疾病外,還包括由特定基因失活突變引起的早發(fā)性隱性遺傳疾病。有報(bào)道編碼分選蛋白Sorting nexin 14(SNX14)的SNX14基因突變后引起常染色體隱性脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)并伴有小腦浦肯野細(xì)胞的缺失,但由于缺乏整體動(dòng)物的研究,我們對(duì)SNX14突變導(dǎo)致該疾病的分子機(jī)制依然未知。SNX14屬于sorting nexin家族成員,主要在細(xì)胞膜泡運(yùn)輸、信號(hào)傳導(dǎo)中起重要作用。為了進(jìn)一步探索SNX14在小腦和浦肯野細(xì)胞的細(xì)胞分子功能,我們構(gòu)建了在全腦和小腦浦肯野細(xì)胞Snx14條件性敲除小鼠,并對(duì)這些小鼠進(jìn)行一系列表型和機(jī)制的研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn),Snx14全腦敲除小鼠的運(yùn)動(dòng)能力有嚴(yán)重缺陷,病理檢查發(fā)現(xiàn)該品系小鼠小腦的整體形態(tài)無明顯改變,但小腦中浦肯野細(xì)胞出現(xiàn)了大量的缺失,并隨年齡增加有加重的趨勢。同時(shí),,Snx14浦肯野細(xì)胞特異性敲除小鼠也表現(xiàn)出了類似的運(yùn)動(dòng)障礙和浦肯野細(xì)胞缺失,提示Snx14全腦敲除小鼠的病理表型是由浦肯野細(xì)胞自主性死亡引起的。接下來,我們用透射電鏡觀察到Snx14條件性敲除小鼠的浦肯野細(xì)胞線粒體形態(tài)異常、電子密度增大且顆粒變小。作為一種分選蛋白,SNX14可能通過與貨物蛋白的相互作用而發(fā)揮運(yùn)輸功能,因此我們用LS-MS質(zhì)譜分析技術(shù)找到了一些與SNX14相互作用的蛋白,其中包括一些已知與小腦脊髓性共濟(jì)失調(diào)密切相關(guān)的分子,如AMPD2、CTND2和VPP1。我們猜測SNX14缺失可能影響了與其相互作用的蛋白的生物功能,進(jìn)而導(dǎo)致浦肯野細(xì)胞的退化缺失和共濟(jì)失調(diào)的表型。另一方面,我們?cè)贖ela細(xì)胞中觀察到SNX14與溶酶體的標(biāo)志物有共定位。綜上所述,我們通過實(shí)驗(yàn)證明了 SNX14缺失直接導(dǎo)致了浦肯野細(xì)胞的退化缺失,這很可能是小鼠出現(xiàn)小腦共濟(jì)失調(diào)的重要原因。另外,我們找到了一些SNX14的關(guān)鍵相互作用蛋白,這為后續(xù)深入的機(jī)制研究提供思路。同時(shí),也為治療藥物的研發(fā)提供了重要的動(dòng)物模型工具。
【圖文】：

＜ＳｉＶ幻４在疾病發(fā)展中及小腦組織中的作用，我們與賽業(yè)公司合作使用ＫＯ邋Ｆｉｒｓｔ逡逑的技術(shù)構(gòu)建了邐以條件性基因敲除小鼠，特異性敲除鼠源ＭＭ基因的第９－１２逡逑號(hào)外顯子區(qū)域（圖３．１Ａ），因?yàn)樵摱问切∧X脊髓共濟(jì)失調(diào)患者５７ＶＺ以突變的高發(fā)逡逑區(qū)。將得到的＊Ｓ＞ｉｘｉ４ｙＺｏｘ小鼠分別與Ｎｅｓｔｉｎ－ｃｒｅ和Ｐｃｐ２－ｃｒｅ邋（購自南方模式動(dòng)物逡逑公司）轉(zhuǎn)基因小鼠交配，得到分別在全腦及浦肯野細(xì)胞中特異性敲除的小逡逑鼠。逡逑在得到敲除小鼠后，我們首先對(duì)三種不同基因型的小鼠：野生型（ＷＴ）、雜逡逑合子（Ｎｅｓｔｉｎ－ｃｒｅ；５＞ｕ：７嚴(yán)）和純合敲除小鼠（Ｎｅｓｔｉｎ－ｃｒｅ；＊Ｓ＞ｉｘｉ產(chǎn)）進(jìn)行了基因型逡逑鑒定，證明基因己被敲除（圖３．１Ｂ）。其次在蛋白水平上，Ｎｅｓｔｉｎ－ｃｒｅ＾Ｗ＃逡逑小鼠在小腦、皮層和海馬均未檢測到ＳＮＸ１４蛋白表達(dá)，而在肝臟、肺和脾等外逡逑周臟器中則有正常表達(dá)，，提示ＳＮＸ１４在中樞特異性敲除（圖３．１Ｃ）。逡逑３６逡逑

齡的邋Ｎｅｓｔｉｎ－ｃＫＯ邋小鼠（Ｎｅｓｔｉｎ－ｃｒｅ；＜Ｓｎｘ７＃）與對(duì)照小鼠（５＞認(rèn)／４／／＋、氣逡逑Ｎｅｓｔｉｎ－ｃｒｅ；１Ｓ１ｎｘｉ４／／＋）在行動(dòng)步態(tài)與綜合運(yùn)動(dòng)能力上的差異。在足跡實(shí)驗(yàn)中，我們逡逑發(fā)現(xiàn)一個(gè)月齡的Ｎｅｓｔｉｎ－ｃｒｅ沒ｗＪ＃小鼠步態(tài)散亂（圖３．２），在準(zhǔn)確測量步長距離逡逑（ｓｔｒｉｄｅ邋ｌｅｎｇｔｈ）和同掌之間的步間距離（ｏｖｅｒｌａｐ邋ｌｅｎｇｔｈ）后發(fā)現(xiàn)邋Ｎｅｓｔｉｎ－ｃｒｅ；５＞ｕ：／戶ｆ逡逑小鼠步長要略短于對(duì)照小鼠（圖３．３Ａ），并且同掌之間的前后肢的距離也要比對(duì)逡逑照小鼠更寬（圖３．３Ｂ），說明Ｎｅｓｔｉｎ－ｃｒｅ；１Ｓ？ｘ７／0Ｊ、鼠行動(dòng)步態(tài)在敲除后受到逡逑了影響。在轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)在測試的第三天，Ｎｅｓｔｉｎ－ｃｒｅ；＜Ｓ＞ｚｘ７／〃相比于對(duì)逡逑照小鼠會(huì)更早的從轉(zhuǎn)棒上掉落（圖３．３Ｃ），說明Ｎｅｓｔｉｎ－ｃｒｅＪ／ｕｃｉ／ｉ小鼠在逡逑敲除后運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力明顯下降。逡逑接下來，我們又用同樣的行為學(xué)范式測試了兩個(gè)月齡的Ｎｅｓｔｉｎ－ｃｒｅｆｗｃｉ，逡逑小鼠與對(duì)照小鼠（５＞２；＜：７４＃＋、和Ｎｅｓｔｉｎ－ｃｒｅ；＜ＳＷｊｃｉ＜／／＋）在行動(dòng)步態(tài)與綜合運(yùn)逡逑動(dòng)能力上的差異。在足跡實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)兩個(gè)月齡的Ｎｅｓｔｉｎ－ｃｒｅ加；鼠步逡逑長明顯比對(duì)照小鼠更短（圖３．４Ａ），步間距也更寬（圖３．４Ｂ），這提示隨著小鼠逡逑年齡的增加
【學(xué)位授予單位】：廈門大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R744.7

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 馬秀娥;崔映宇;陳義漢;;分選鏈接蛋白家族研究進(jìn)展[J];科學(xué)通報(bào);2014年35期

本文編號(hào)：2604350