【摘要】：研究背景:膠質母細胞瘤(glioblastoma)是中樞神經系統(tǒng)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤。生存期大多不足一年。目前雖然在手術、化放療及分子治療上都取得了一定的進展,但是大多數患者的預后仍然很差。腫瘤的高侵襲性和高復發(fā)率是主要致死原因。所以,了解膠質母細胞瘤的生物學特點和分子機制可以為預防和早期診斷奠定基礎,同時,也為臨床治療和改善預后提供新的思路和途徑。microRNA(miRNA)作為近幾年的研究熱點,在腫瘤中的研究雖然還處于起步階段,但其作為原癌基因或抑癌基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展及治療和預后中的作用正被越來越的科學家們所關注,并期望其能夠在腫瘤的診斷和治療中提供必要的靶點支持。miRNAs的研究已經證實:miRNAs幾乎參與腫瘤的所有重要生物學過程,包括:細胞增殖、細胞凋亡、細胞遷移和侵襲、細胞分化和耐藥等,而且它們的產生和表達受遺傳變異、表觀遺傳調控和腫瘤微環(huán)境多種因素的影響。目前多種miRNA在膠質母細胞瘤中的作用陸續(xù)被報道。其中,miR-29、miR-124、miR-181、miR-7等在膠質母細胞瘤中起抑制腫瘤侵襲和腫瘤血管生成的作用;而miR-21、miR-10b、miR-221/222、miR-93等起促進腫瘤侵襲及腫瘤血管生成的作用。miR-16作為miRNA家族的一個成員,在慢性淋巴細胞白血病中首次被發(fā)現(xiàn)時,被認為是一抑癌基因。最近幾年的一些研究發(fā)現(xiàn):在膽管癌、膀胱癌、非小細胞肺癌等許多實體腫瘤中,miR-16的表達下調,提示miR-16可能是通過抑制靶基因作用參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的。然而,也有部分研究者證實:.在胃癌、卵巢癌等一些腫瘤中miR-16的表達上調,對腫瘤有促進作用,發(fā)揮原癌基因的功能。這些研究說明miR-16可能存在器官特異性,在不同腫瘤中起抑癌基因或原癌基因的作用。至今miR-16在膠質母細胞瘤中的作用仍少有人報道。目前研究結論支持miR-16在膠質母細胞瘤中起抑癌基因的作用。主要作用方式是與靶基因特異性相結合,抑制腫瘤的機制也從細胞增殖、凋亡、細胞周期以及細胞侵襲和轉移等不同方面有所發(fā)現(xiàn)。為了探討miR-16在膠質母細胞瘤中的作用及可能的分子機制,本研究通過數據庫TargetScan和miRanda將miR-16的目的基因進行預測并篩選,結果顯示:Wip-1的3'-UTR能夠特異性地與miR-16的5'-UTR相互結合,提示miR-16與Wip1存在一定的靶向關系。Wip1是PP2C(protein phosphatase2C)家族的一種蛋白磷酸酶,作用于絲氨酸(Serine)/蘇氨酸(Threonine)位點。Wip1是一種原癌基因,在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。ATM和p53作為公認的抑癌基因,已經被證實都是Wip1的靶基因。Wip1通過去磷酸化ATM和p53,使二者失去活性,進而促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展�；谝陨涎芯勘尘�,本文提出科學假說:miR-16靶向調控Wip1介導Wip1-ATM-p53信號通路抑制膠質母細胞瘤生長。在信號傳導中,蛋白質可以通過獲得磷酸基團而被激活;通過去除磷酸基團而失去活性。如前所述,Wip1是一種絲/蘇氨酸位點的蛋白磷酸酶,通過對靶蛋白的去磷酸化作用行使癌基因的功能。而ATM和P53都是Wip1的靶蛋白,能被Wip1去磷酸化而抑制。在膠質母細胞瘤中磷酸化ATM(p-ATM)和磷酸化P53(p-P53)的蛋白表達水平究竟有無變化,也將是本研究要探討的一個問題。為此,本文從體外細胞功能實驗驗證miR-16與Wip1-ATM-p53信號通路對膠質母細胞瘤細胞增殖、侵襲、凋亡和細胞周期的作用,體內裸鼠原位移植瘤實驗進一步驗證miR-16的抑瘤作用,初步探討miR-16抑制膠質母細胞瘤的分子機制。目的:本文旨在探討miR-16靶向調控Wip1-ATM-p53信號通路,及其在抑制膠質母細胞瘤生長、侵襲中的作用及可能的分子機制。方法:采用SHG44、U87和U251三株膠質母細胞瘤的細胞系,通過細胞轉染建立miR-16高表達組及其對照組,分別進行細胞克隆形成實驗、EDU細胞增殖實驗、細胞侵襲實驗、細胞凋亡實驗和細胞周期實驗。利用生物信息數據庫對miR-16的基因調控網絡進行分析,并對靶基因進行預測:Wip1可能是miR-16的靶基因。miR-16與Wip1的靶向關系通過雙熒光素酶報告基因實驗進行驗證。體外細胞實驗分為兩組(miR-16mimic組和對照組),應用qRT-PCR檢測各組Wip1、ATM和p53 mRNA表達;應用Western blot檢測各組Wip1、ATM、P53、p-ATM和p-P53蛋白表達。體外實驗將裸鼠分5組,miR-16高表達組(agmir組)、低表達組(antagomir組)及各自相對應的對照組(NC組)和空白對照組(control組)。裸鼠原位移植瘤應用Western blot實驗,分別檢測各組Wip1、ATM、P53、p-ATM和p-P53蛋白表達;qRT-PCR和免疫組織化學(immunohistochemistry)分別檢測各組Wip1、ATM、p53的mRNA和蛋白表達。結果:高表達miR-16的SHG44、U87和U251三株細胞,與NC組相比,細胞克隆形成數均顯著減少(t=1 1.300,p0.01;t=8.812,p0.01;t=11.857,p0.01);細胞增殖數均顯著下降(t=26.67,p0.01;t=10.776,p0.01;t= 10.096,p0.01);細胞的侵襲細胞數減少(t=6.683,p0.01;t=8.181,p0.01;t=7.578,p0.01);早期細胞凋亡率顯著升高(t=4.918,p0.05;t=4.006,p0.05;t=3.573,p0.05);處于 G1期細胞數明顯增多(t=6.392,p0.05;t=9.802,p0.05;t=8.975,p0.01),S 期細胞數明顯減少(t=4.643,p0.05;t=6.284,p0.05;t=5.009,p0.01)。雙熒光素酶報告基因結果表明過表達miR-16時,野生型Wip1的熒光素酶活性與NC組比較顯著降低(t=4.481,p0.05);突變型Wip1的熒光素酶活性與NC組相比差異不明顯(t=0.693,p0.05)。Wip1是miR-16特異結合靶點。體外細胞qRT-PCR實驗結果表明過表達miR-16與對照組相比,三種細胞的 Wip1 的 mRNA 表達降低(t=8.589,p0.01;t=8.034,p0.01;t=7.727,p0.01),ATM 的 mRNA 表達升高(t=4.304,p0.05;t=7.407,p0.05;t=6.530,p0.05),同時 p53 的 mRNA 表達也升高(t=4.879,p0.01;t=5.946,p0.01;t=4.818,p0.01)。Western blot 實驗結果表明過表達 miR-16 與對照組相比,Wip1 蛋白表達降低(t=9.918,p0.01;t=5.646,p0.01;t=5.609,p0.01),p-ATM 蛋白表達升高(t=4.785,p0.01;t=9.484,p0.01;t=4.464,p0.05),同時 p-P53 蛋白表達也升高(t=3.848,p0.05;t=3.024,p0.05;t=4.222,p0.05)。而 ATM 蛋白表達差異不明顯(t=1.938,p0.05;t=2.152,p0.05;t=2.670,p0.0),P53 蛋白表達差異也不明顯(t=2.589,p0.05;t=2.189,p0.05;t=1.859,p0.05)。裸鼠顱內原位移植瘤實驗表明空白對照組與正常腦組織相比,裸鼠顱內原位成瘤中的miR-16明顯減低(t=2.836,p0.05)。miR-16過表達組腫瘤體積明顯小于NC組(t=9.643,p0.01),miR-16低表達組腫瘤體積明顯大于NC組(t=13.29,p0.01)。qRT-PCR結果表明miR-16過表達組的Wip1基因表達下調(t=8.515,p0.05),而ATM和p53基因表達上調(t=5.430,p0.05;t=5.213,p0.05);與其形成對比的是,miR-16低表達組的Wip1基因表達水平明顯高于其NC組(t=3.690,p0.05),而ATM和 p53 基因表達水平低于其 NC 組(t=3.106,p0.05;t=2.808,p0.05)。Western blot實驗結果表明Wip1蛋白在miR-16過表達組表達下調(t=5.383,p0.01),而 p-ATM 和 p-P53 蛋白表達上調(t=4.35,p0.01;t=2.648,p0.05);反之,Wip1蛋白在miR-16低表達組表達上調(t=6.200,p0.01),而p-ATM和 p-P53 蛋白表達下調(t=5.828,p0.01;t=4.537,p0.01);ATM 和 P53 的蛋白表達量在miR-16高表達(t=1.133,p0.05;t=-0.019,p0.05)和低表達(t=0.149,p0.05;t=-0.157,p0.05)時組間差異不顯著。免疫組化實驗結果顯示Wip1蛋白在miR-16過表達時的表達減弱(t=2.428,p0.05),而p-ATM 和 p-P53 蛋白在 miR-16 過表達時表達增強(t=2.291,p0.05;t=2.494,p0.05);相反,miR-16 低表達時,Wip1 蛋白表達增強(t=2.352,p0.05),而 p-ATM 和 p-P53 蛋白表達減弱(t=2.397,p0.05;t=2.013,p0.05);ATM和 P53 蛋白在 miR-16 高表達(t=1.423,p0.05;t=0.158,p0.05)和低表達(t=0.935,p0.05;t=0.458,p0.05)時組間差異均不顯著(p0.05);結論:(1)miR-16抑制膠質母細胞瘤SHG44、U87和U251細胞的增殖和侵襲能力。(2)Wip1是miR-16的靶基因,miR-16通過調控Wip1-ATM-p53信號通路抑制膠質母細胞瘤生長。
【圖文】：

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圖３過表達ｍｉＲ－１６抑制ＳＨＧ４４、Ｕ８７和Ｕ２５１細胞的增殖能ＥＤＵ增殖實驗中，與對照組（ＮＣ組）相比，過表達ｍｉＲ－１６組的ＳＨ７邋和邋Ｕ２５１邋細胞的增殖顯著下降（ｔ＝２６．６７，ｐ＜０．０１；ｔ＝１０．７７６，，ｐ＜０．０１；ｔ＝．０１），結果表明過表達ｍｉＲ－１６抑制ＳＨＧ４４、Ｕ８７和Ｕ２５１細胞的
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R739.4

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本文編號：2602756