【摘要】：背景:臨床研究表明,在缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury,IRI)中,缺血的組織或器官重新再恢復(fù)血液供給的話,會出現(xiàn)嚴(yán)重的機(jī)能障礙并伴隨著組織損傷加重和炎癥反應(yīng)應(yīng)答。而缺血再灌注損傷已成為當(dāng)今世界致殘和死亡的主要原因。已有研究發(fā)現(xiàn)RTNs家族蛋白可以誘導(dǎo)凋亡,抑制軸突再生和調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)運(yùn)輸。其中RTN1又被稱為神經(jīng)內(nèi)分泌蛋白,并在腦組織中表達(dá)豐富。然而,對于RTNs在缺血再灌注中促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的機(jī)制并不清楚。本研究我們發(fā)現(xiàn)RTN1-C在大鼠I/R模型和細(xì)胞氧糖剝奪再灌注模型(OGD/R模型)中均有特異性的升高,并可通過線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的通路誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。動物水平敲低RTN1-C可以減輕腦缺血再灌注損傷,這種減輕與線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的凋亡蛋白水平的降低密切相關(guān)。因此,RTN1-C參與到腦缺血再灌注中的損傷作用,其機(jī)制與誘導(dǎo)線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的凋亡通路有關(guān)。目的:探究RTN1-C在腦缺血再灌注中對神經(jīng)細(xì)胞的影響,為腦缺血再灌注損傷的治療方法提供新的線索。方法:通過免疫印跡和免疫熒光實(shí)驗(yàn)證明RTN1-C在腦缺血/再灌注中表達(dá)上調(diào)。在OGD/R模型中,將RTN1-C過表達(dá)后,免疫熒光,CCK-8,流式實(shí)驗(yàn)證明細(xì)胞凋亡增加并且細(xì)胞對缺血性損傷的易感性增加,而敲低RTN1-C后可以逆轉(zhuǎn)由缺血誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡并減弱OGD/R處理的神經(jīng)細(xì)胞的易感性。WB實(shí)驗(yàn)證明了在OGD/R模型中RTN1-C可以通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和線粒體相關(guān)的通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。通過免疫沉淀實(shí)驗(yàn)證明了RTN1-C與Bcl-x L相互作用并增加其在ER中的定位,從而減少Bcl-x L抗凋亡的活性。在大鼠MCAO模型中,通過免疫熒光,TTC染色,大鼠的神經(jīng)學(xué)評分實(shí)驗(yàn)證明敲低RTN1-C后大鼠神經(jīng)細(xì)胞的凋亡率降低。結(jié)果:1.RTN1-C在腦缺血再灌注中表達(dá)呈特異性上調(diào)(1)蛋白免疫印跡:RTN1-C在腦缺血再灌注12小時和24小時,其表達(dá)逐漸增加,而RTN1-A和RTN1-B的表達(dá)沒有變化。RTN1-C在腦損傷即腦缺血再灌注模型中呈高表達(dá),在腦保護(hù)模型即缺血后處理和瑞芬太尼后處理組呈低表達(dá)。(2)免疫熒光染色:隨著再灌注損傷時間的延長,分別取再灌注0小時,12小時,24小時后腦組織進(jìn)行固定染色,RTN1-C(綠色)、DAPI(藍(lán)色),圖像重疊后顯示:隨著再灌注時間的延長,腦組織中RTN1-C的表達(dá)逐漸增加。2.在腦缺血再灌注中RTN1-C促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡(1)免疫熒光染色:在腦缺血再灌注24h后對腦組織進(jìn)行固定染色,其中RTN1-C(綠色)、活化的Caspase3(紅色)、DAPI(藍(lán)色),圖像重疊后顯示,與正常組相比,腦缺血再灌注24h后,活化的Caspase3陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增加。(2)細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn):CCK-8實(shí)驗(yàn)表明,在細(xì)胞OGD/R模型中,過表達(dá)RTN1-C后,神經(jīng)細(xì)胞的活力降低,敲低RTN1-C后,神經(jīng)細(xì)胞的活力升高。(3)流式實(shí)驗(yàn):在細(xì)胞OGD/R模型中,將RTN1-C過表達(dá)后,神經(jīng)細(xì)胞的凋亡增加,RTN1-C敲低后,神經(jīng)細(xì)胞的凋亡降低。3.在OGD/R模型中,RTN1-C可以誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的凋亡(1)在N2a細(xì)胞中分別過表達(dá)RTN1-C和敲低RTN1-C后,然后進(jìn)行OGD/R處理后,蛋白免疫印跡檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白Grp78,活化的Caspase-12,CHOP,活化的Caspase-3的表達(dá),發(fā)現(xiàn)OGD/R處理后RTN1-C增加了Grp78,活化的Caspase-12,CHOP,活化的Caspase-3的表達(dá)。(2)為了進(jìn)一步證實(shí)RTN1-C參與到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的凋亡,將N2a細(xì)胞過表達(dá)RTN1-C-GFP質(zhì)粒,用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的抑制劑4-PBA處理6小時后,然后再進(jìn)行OGD/R處理,之后蛋白免疫印跡檢測Grp78,活化的Caspase-12,CHOP,活化的Caspase-3的蛋白水平。結(jié)果表明4-PBA處理后,Grp78,活化的Caspase-12,CHOP,活化的Caspase-3的表達(dá)顯著抑制。4.在OGD/R模型中,RTN1-C可以誘導(dǎo)線粒體相關(guān)的凋亡(1)為了證明RTN1-C通過線粒體相關(guān)的凋亡途徑參與到腦缺血再灌注損傷,Western blotting檢測相關(guān)凋亡蛋白細(xì)胞色素C和活化的Caspase-3的水平,結(jié)果表明OGD/R處理后,胞質(zhì)中細(xì)胞色素C的含量增加,線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素C含量減少,活化的Caspase-3的表達(dá)增加,而RTN1-C過表達(dá)后,胞質(zhì)中細(xì)胞色素C和活化的Caspase-3的含量增加,反之敲低RTN1-C后,這些蛋白水平降低。(2)為了探究在OGD/R模型中,RTN1-C與Bcl-xL的相互作用情況以及RTN1-C是否改變Bcl-x L的亞細(xì)胞定位,通過免疫沉淀和WB實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)OGD/R處理后,RTN1-C與Bcl-x L的相互作用增強(qiáng),胞質(zhì)中Bcl-x L含量增加,而過表達(dá)RTN1-C后,從線粒體異位到胞質(zhì)中Bcl-xL含量顯著增加。5.在腦缺血再灌注模型中,敲低RTN1-C后可以降低細(xì)胞的凋亡(1)免疫熒光染色:為了進(jìn)一步證明在大鼠I/R模型中RTN1-C敲低是否能夠降低神經(jīng)細(xì)胞的凋亡,組織免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,敲低RTN1-C后,與對照組相比活化的Caspase3陽性細(xì)胞數(shù)量明顯減少。這說明敲低RTN1-C后可以下調(diào)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。(2)TTC染色:為進(jìn)一步探究敲低RTN1-C對腦缺血再灌注損傷的治療效果,我們對大鼠腦組織進(jìn)行TTC染色發(fā)現(xiàn),在假手術(shù)組中未見梗死區(qū)域,而在再灌注24小時組中可見明顯的蒼白色的梗死病灶,與對照組相比,敲低RTN1-C后大腦的梗死面積明顯降低。(3)神經(jīng)功能評分:采用Bederson評分標(biāo)準(zhǔn)來對MACO大鼠模型中神經(jīng)學(xué)功能進(jìn)行評分并探究敲低RTN1-C是否參與神經(jīng)損傷的保護(hù)作用,結(jié)果表明在感染Lv-shRTN1-C的MACO大鼠組中,與Lv-NC MACO大鼠組相比神經(jīng)學(xué)功能明顯改善。結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)通過免疫熒光,蛋白免疫印跡,流式細(xì)胞技術(shù)等實(shí)驗(yàn)證實(shí)了RTN1-C在腦缺血再灌注中通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和線粒體相關(guān)的凋亡促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡,這為今后治療腦缺血再灌注損傷提供了新的途徑。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R743

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本文編號：2602702