【摘要】：目的:利用膠質(zhì)瘤樣本數(shù)據(jù)庫(kù)探討PLK4在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及與病理級(jí)別、預(yù)后以及化療敏感性的相關(guān)性;借助RNA干擾結(jié)合表型實(shí)驗(yàn)在體內(nèi)外證實(shí)PLK4對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及對(duì)TMZ化療敏感性的影響;進(jìn)一步我們驗(yàn)證了課題組之前通過(guò)實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)的PLK4與IκKε結(jié)合形成復(fù)合物從而激活I(lǐng)κKε/NF-κB/BCL2抗凋亡信號(hào)通路導(dǎo)致腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及對(duì)替莫唑胺化療敏感性影響的機(jī)制,為對(duì)替莫唑胺化療耐藥的腦膠質(zhì)瘤的治療提供新的思路。方法:1.利用CGGA數(shù)據(jù)庫(kù)中RNA-seq數(shù)據(jù)分析PLK4在WHO分級(jí)(II、III、IV)中m RNA表達(dá)水平;同時(shí)分析PLK4表達(dá)水平與患者完全生存周期的相關(guān)性,以及PLK4表達(dá)狀態(tài)與化療對(duì)患者生存期的影響。2.利用real-time PCR測(cè)定人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87MG,U251,LN229,U87EGFRv III中PLK4 m RNA表達(dá)水平;收集不同病理級(jí)別的人腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本,real-time PCR測(cè)定每例組織標(biāo)本中PLK4 m RNA的表達(dá)情況,蛋白免疫印跡測(cè)定人腦膠質(zhì)瘤組織中PLK4蛋白表達(dá)情況;3.構(gòu)建靶向PLK4的小分子干擾RNA,轉(zhuǎn)染入U(xiǎn)87MG,LN229細(xì)胞系,real-time PCR測(cè)定干擾序列敲低PLK4的敲低效率;用MTT實(shí)驗(yàn)和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)測(cè)定敲低PLK4后細(xì)胞增殖能力;利用細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證敲低PLK4后對(duì)中心粒的影響;利用MTT試驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞敲低PLK4后對(duì)TMZ化療敏感性影響。4.利用U87MG細(xì)胞構(gòu)建裸鼠顱內(nèi)膠質(zhì)瘤模型,設(shè)置對(duì)照組、敲低PLK4組,TMZ單純治療組,敲低PLK4聯(lián)合TMZ治療組,采取周期TMZ治療,體內(nèi)驗(yàn)證下調(diào)PLK4表達(dá)使腫瘤細(xì)胞對(duì)TMZ化療敏感性增加。5.構(gòu)建靶向NF-κB的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒p NFκB-luc,利用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證NF-κB是PLK4下游的效應(yīng)靶點(diǎn)。6.利用細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PLK4與IκKε蛋白在細(xì)胞中定位情況;蛋白免疫印跡法測(cè)定下調(diào)PLK4后,IκBα蛋白表達(dá)水平;細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證下調(diào)PLK4后,NF-κB-p65蛋白定位變化;驗(yàn)證PLK4可以與IκKε結(jié)合形成復(fù)合物,導(dǎo)致IκBα降解并促進(jìn)NF-κB-p65進(jìn)入細(xì)胞核。7.設(shè)計(jì)BCL2抗凋亡基因PCR引物,利用real-time PCR測(cè)定細(xì)胞敲低PLK4 表達(dá)后,BCL2抗凋亡基因mRNA表達(dá)水平的變化,證明下調(diào)PLK4表達(dá)后抑制BCL2抗凋亡活性從而使腫瘤細(xì)胞對(duì)TMZ化療敏感性增加。結(jié)果:1在CGGA膠質(zhì)瘤樣本m RNA表達(dá)譜中分析顯示,PLK4 m RNA的表達(dá)與膠質(zhì)瘤WHO病理分級(jí)存在明顯正相關(guān);PLK4高表達(dá)患者完全生存期明顯縮短,且PLK4在高級(jí)別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)差異對(duì)患者完全生存期有明顯影響;PLK4低表達(dá)狀態(tài)的患者,化療后患者生存期明顯延長(zhǎng),PLK4高表達(dá)的患者,化療后患者生存期無(wú)明顯變化。證明PLK4在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)存在差異,且與病理分級(jí)、患者預(yù)后以及化療敏感性明顯相關(guān)。2.膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中PLK4 m RNA表達(dá)水平均較正常細(xì)胞增高,其中U87MG、LN229較高;人腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本中PLK4 m RNA均有表達(dá),高級(jí)別膠質(zhì)瘤表達(dá)水平較低級(jí)別膠質(zhì)瘤明顯增高;但在PLK4蛋白表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤病理分級(jí)無(wú)明顯相關(guān)。3.轉(zhuǎn)染靶向PLK4小分子干擾RNA后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中,PLK4表達(dá)明顯下調(diào);細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示下調(diào)PLK4表達(dá)后中心粒數(shù)目減少;MTT實(shí)驗(yàn)及克隆形成實(shí)驗(yàn)均顯示,下調(diào)PLK4表達(dá)后,膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖能力明顯減弱;MTT實(shí)驗(yàn)顯示,下調(diào)PLK4表達(dá)后,細(xì)胞對(duì)TMZ的化療敏感性明顯增加。4.U87MG顱內(nèi)膠質(zhì)瘤裸鼠動(dòng)物模型顯示,抑制PLK4聯(lián)合TMZ治療后,腫瘤生長(zhǎng)速度明顯減慢,動(dòng)物完全生存期明顯延長(zhǎng),HE染色顯示聯(lián)合治療組的腫瘤邊界較正常組明顯縮小。免疫組織化學(xué)染色顯示Ki-67表達(dá)水平明顯減低。5.熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示,膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中PLK4表達(dá)下調(diào)后,NF-κB熒光強(qiáng)度較正常細(xì)胞組下降,證明NF-κB是PLK4下游的效應(yīng)靶點(diǎn)。6.細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)證實(shí)PLK4與IκKε存在蛋白共定位,證實(shí)PLK4可以與IκKε結(jié)合形成復(fù)合物;下調(diào)PLK4表達(dá)后,NF-κB p65亞基定位由細(xì)胞核轉(zhuǎn)入細(xì)胞質(zhì)。7.蛋白免疫印跡顯示細(xì)胞下調(diào)PLK4后,IκBα表達(dá)水平上調(diào),證明PLK4能夠結(jié)合并磷酸化IκKε,使IκBα降解,從而導(dǎo)致下游信號(hào)通路的激活。8.膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中PLK4表達(dá)下調(diào)后,BCL2抗凋亡基因家族中BCL2-A1、BCL2-L1 m RNA表達(dá)水平下調(diào),驗(yàn)證了PLK4激活了下游NF-κB/BCL2抗凋亡信號(hào)通路。結(jié)論:1.PLK4在腦膠質(zhì)瘤中高表達(dá),PLK4的表達(dá)與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān),且在高級(jí)別膠質(zhì)瘤中明顯相關(guān)。2.PLK4低表達(dá)狀態(tài)增加患者對(duì)化療敏感性,延長(zhǎng)患者生存期。3.PLK4在腦膠質(zhì)瘤中高表達(dá),其中PLK4 m RNA表達(dá)水平與病理級(jí)別呈正相關(guān);蛋白表達(dá)水平與病理級(jí)別無(wú)明顯相關(guān)。4.下調(diào)PLK4的表達(dá)可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖以及增強(qiáng)對(duì)TMZ化療敏感性。5.PLK4能夠結(jié)合IκKε,從而激活NF-κB信號(hào)通路,促進(jìn)BCL2抗凋亡基因的表達(dá),從而使膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)TMZ化療敏感性降低,與課題組之前預(yù)測(cè)的信號(hào)通路相一致。6.下調(diào)PLK4表達(dá)聯(lián)合TMZ治療可以對(duì)膠質(zhì)瘤存在治療效果。
【圖文】：

GA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析 PLK4mRNA 表達(dá)與膠質(zhì)瘤病理級(jí)別的關(guān)系。患者標(biāo)本 WH121 例，Ⅲ級(jí) 50 例，Ⅳ級(jí) 127 例，共 298 例。步分析 PLK4 與患者生存期的關(guān)系后發(fā)現(xiàn)：PLK4mRNA 表達(dá)水存期呈負(fù)相關(guān)（如圖 2），，且在高級(jí)別膠質(zhì)瘤中明顯相關(guān)（P<0.0圖 3-A）；而在低級(jí)別膠質(zhì)瘤中無(wú)明顯相關(guān)（P>0.05，如圖 3-B）。

GGA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析 PLK4mRNA 表達(dá)與膠質(zhì)瘤病理級(jí)別的關(guān)系�；颊邩�(biāo)本 W121 例，Ⅲ級(jí) 50 例，Ⅳ級(jí) 127 例，共 298 例。一步分析 PLK4 與患者生存期的關(guān)系后發(fā)現(xiàn)：PLK4mRNA 表達(dá)水生存期呈負(fù)相關(guān)（如圖 2），且在高級(jí)別膠質(zhì)瘤中明顯相關(guān)（P<0如圖 3-A）；而在低級(jí)別膠質(zhì)瘤中無(wú)明顯相關(guān)（P>0.05，如圖 3-B）
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R739.41

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本文編號(hào)：2597503