【摘要】：第一部分重慶地區(qū)3、7型腺病毒肺炎兒童并發(fā)中毒性腦病的臨床特征分析目的:人腺病毒(Human Adenovirus,HAdV)是兒童呼吸道感染的常見病原,其中HAdV-3和HAdV-7是引起兒童重癥肺炎的主要原因之一,中毒性腦病是HAdV-3和HAdV-7肺炎的重要并發(fā)癥。大量臨床資料顯示HAdV-7感染病情嚴(yán)重程度明顯重于HAdV-3,但兩型肺炎并發(fā)中毒性腦病嚴(yán)重程度是否存在差異尚不清楚。本部分回顧性分析HAdV-3和HAdV-7肺炎住院患兒并發(fā)中毒性腦病的臨床特點(diǎn)。方法:收集2009年6月至2014年12月因急性下呼吸道感染在重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院呼吸病房住院且確診為腺病毒感染患兒的鼻咽分泌物,提取DNA行PCR擴(kuò)增后基因測序,Gen Bank比對分型,回顧性分析患兒臨床資料,探討兩型腺病毒肺炎并發(fā)中毒性腦病是否存在差異。結(jié)果:1.HAdV陽性率及分型:2009年6月至2014年12月,共收集急性下呼吸道感染住院患兒鼻咽抽吸物標(biāo)本4678份,其中HAdV陽性307例(6.56%),成功測序分型280例。HAdV-7(129,45.09%)和HAdV-3(122,43.41%)是主要的血清型。2.HAdV-3和HAdV-7的臨床特點(diǎn):280例中HAdV-7與HAdV-3肺炎患兒相比,HAdV-7肺炎患兒更易出現(xiàn)高熱、喘息,重癥肺炎的發(fā)生率更高,易并發(fā)中毒性腦病和呼吸衰竭(p0.05)。3.重癥HAdV肺炎并發(fā)中毒性腦病的臨床特點(diǎn):280例中29例(29/280,10.32%)重癥肺炎并發(fā)中毒性腦病。HAdV-7(23/29,79.31%)是并發(fā)中毒性腦病的主要血清型(p0.05)。結(jié)論:HAdV是兒童急性下呼吸道感染的病原之一,其檢出率為6.56%,HAdV-7和HAdV-3是檢出的主要血清型。HAdV-7肺炎的患兒病情更重,更易發(fā)生中毒性腦病。第二部分3、7型腺病毒肺炎并發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的實(shí)驗(yàn)研究目的:第一部分結(jié)果提示HAdV-7重癥肺炎較HAdV-3易并發(fā)中毒性腦病,本部分?jǐn)M建立腺病毒感染動物模型探討兩型腺病毒肺炎并發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的實(shí)驗(yàn)研究。方法:1.體外,收集臨床分離株HAdV-3、HAdV-7分別感染以及兩者1:1混合感染A549細(xì)胞后0、2、8、12、24、36、48和72h標(biāo)本,同時(shí)收集感染大鼠神經(jīng)元細(xì)胞24h的上清標(biāo)本,上清通過實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(q-PCR)檢測其病毒拷貝數(shù)。2.體內(nèi),臨床分離株HAdV-3 HAdV-7感染BALB/c建立腺病毒感染動物模型,收取感染后第3、5和7天的標(biāo)本,腦組織、神經(jīng)結(jié)通過免疫熒光檢測病毒。血液和腦組織通過q-PCR檢測病毒載量。結(jié)果:1.HAdV-7在感染A549細(xì)胞后病毒拷貝數(shù)明顯高于HAdV-3(p0.05);HAdV-3在感染大鼠神經(jīng)元原代細(xì)胞后病毒拷貝數(shù)明顯高于HAdV-7(p0.05)。3.HAdV-3和HAdV-7感染BALB/c后3、5和7天,HAdV-7感染組在血液、神經(jīng)結(jié)以及腦組織均未檢測出病毒,腦組織中炎癥介質(zhì)(IL-1β、TNF-α和IL-6)、血清中炎癥介質(zhì)(TNF-α)水平明顯升高(p0.05);HAdV-3感染組腦組織和神經(jīng)結(jié)檢測出病毒,血液內(nèi)未檢測出病毒,腦組織和血清炎癥介質(zhì)水平正常。結(jié)論:HAdV-7毒力強(qiáng)于HAdV-3,但HAdV-3可通過病毒侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)致病毒性腦炎,而HAdV-7通過釋放炎癥介質(zhì)致中毒性腦病。臨床診療中7型腺病毒感染并發(fā)中毒性腦病應(yīng)以阻斷炎癥反應(yīng)為主,而3型腺病毒感染并發(fā)病毒性腦炎需拮抗病毒復(fù)制。第三部分HMGB1介導(dǎo)小鼠的7型腺病毒感染誘導(dǎo)的肺部炎癥目的:第一部分和第二部分結(jié)果提示HAdV-3和HAdV-7是兒童重癥肺炎的重要病原;由于HAdV-7感染釋放大量炎癥介質(zhì),HAdV-7肺炎的住院兒童的病情嚴(yán)重程度明顯高于HAdV-3。因此,尋找治療HAdV-7重癥肺炎的靶點(diǎn)是控制腺病毒的關(guān)鍵。近年來發(fā)現(xiàn)高遷率族蛋白B1(HMGB1)作為內(nèi)源性損傷相關(guān)分子模式(DAMP)的一員,通過壞死的呼吸道上皮細(xì)胞釋放介導(dǎo)了大量炎癥介質(zhì)急性肺部炎癥性疾病。尤其在較多病毒(如腺病毒、流感病毒等)感染導(dǎo)致的肺部炎癥中扮演了重要角色,本研究探討HMGB1在腺病毒肺炎中的作用,尋找HAdV-7肺炎的治療靶點(diǎn)。方法:1.體外,收集HAdV-7感染A549細(xì)胞后0、2、6、8、12、24、36和48小時(shí)的上清和細(xì)胞爬片,通過免疫熒光和ELISA進(jìn)行分析胞外HMGB1的表達(dá)以及水平。2.體內(nèi),收集正常和anti-HMGB1 m Ab BALB/c小鼠感染HAdV-7后第3天、5天和7天的肺組織和BALF標(biāo)本,通過細(xì)胞分類計(jì)數(shù)、組織病理分析、ELISA和q-PCR等方法進(jìn)行分析病毒拷貝數(shù)、HMGB1、TLR4、TLR9、RAGE和NF-κΒ、IL-1β、IL-6和TNF-α等水平。結(jié)果:1.體外,HAdV-7感染A549細(xì)胞后12小時(shí),HMGB1由胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到胞外逐漸增多,感染后24h、36h和48h較Control組顯著升高(p0.05)。體內(nèi),感染后第3、5和7天小鼠肺組織(肺泡灌洗后)蛋白水平逐漸降低(p0.05)。2.體內(nèi),HMGB1在HAdV-7感染小鼠的第3天升高(p0.05),同時(shí),TLR4受體和NF-κΒ在HAdV-7感染小鼠的第3天升高(p0.05)。3.體內(nèi),阻斷HMGB1后,Anti-HMGB1 m Ab HAdV-7組肺組織病毒拷貝數(shù)在感染的3天明顯較HAdV-7組降低,肺組織HE染色病理評分、細(xì)胞分類計(jì)數(shù)均在第3天明顯較HAdV-7組降低(p0.05);TLR4受體、NF-κΒ基因水平在感染的第3天較HAdV-7組明顯減低(p0.05)。結(jié)論:HAdV-7感染后HMGB1由胞內(nèi)向胞外轉(zhuǎn)移;在HAdV-7感染的第3天,HMGB1與TLR4受體結(jié)合激活NF-κΒ觸發(fā)炎癥介質(zhì)的釋放介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和促進(jìn)了病毒的復(fù)制。HMGB1可作為HAdV-7的治療靶點(diǎn)。
【圖文】：

圖 2.1 HAdV-7 與 HAdV-3 病毒復(fù)制能力比較Figure 2. 1 Comparison of virus replication between HAdV-7 and HAdV-3A: HAdV-7 或 HAdV-3 感染 A549 細(xì)胞病變(CPE)，放大 100 倍，標(biāo)尺 50um。B: HAdV-7 或HAdV-3 感染 A549 細(xì)胞后病毒拷貝數(shù)。C：HAdV-7 和 HAdV-3 共感染后病毒拷貝數(shù)（3 復(fù)孔，平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤）。*, **, ***p<0.05,0.01,0.001, 與 HAdV-3 比較A: Cytopathic effect (CPE) of A549 of cell after inoculated HAdV-7 or HAdV-3 (originalMagnification×100); the Scale for 100um (original Magnification×100). B: Relative virus copynumber of HAdV-7 or HAdV-3 in A549 cell. C: Competitive replication between HAdV-3,HAdV-7 in A549 cells (3 replicates each, mean±SEM). *, **, *** p<0.05, 0.01, 0.001, comparingwith HAdV-32.2 HAdV-3 在鼠神經(jīng)元中病毒復(fù)制力高于 HAdV-7

重慶醫(yī)科大學(xué)博士研究生學(xué)位論文受體（紅色），病毒僅見 HAdV-3 表達(dá)（綠色），未見 HAdV-7。為明確 HAdV-3、HAdV-7 在神經(jīng)元細(xì)胞中是否存在病毒復(fù)制差異，本研究收集大鼠神經(jīng)元原代細(xì)胞感染 HAdV-3 和 HAdV-7 后 24 小時(shí)標(biāo)本提取 DNA（因 BALB/c 小鼠神經(jīng)元感染HAdV 6 小時(shí)死亡，故換大鼠神經(jīng)元原代細(xì)胞），q-PCR 檢測病毒拷貝數(shù)，結(jié)果示HAdV-3 的病毒拷貝數(shù)明顯高于 HAdV-7 見圖 2.4。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R725.6;R747.9

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 李亞敏;譚文杰;;兒童腺病毒感染與腦炎相關(guān)性的Meta分析[J];中國循證醫(yī)學(xué)雜志;2014年07期

2 鄧潔;錢淵;趙林清;朱汝南;王芳;孫宇;田潤;;2003～2012年北京兒童急性呼吸道感染中腺病毒監(jiān)測及流行型別分析[J];病毒學(xué)報(bào);2013年06期

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本文編號：2597470