【摘要】：病毒載體存在誘發(fā)基因突變的風險,而非病毒納米基因載體具有優(yōu)異的安全性,因此相關研究受到關注。近年來,不少研究報道了應用陽離子化多糖作為基因載體攜載特定基因進行細胞重編程。多糖具有良好的安全性和低細胞毒性,因此多糖來源的陽離子化碳點,不僅可實現(xiàn)安全的基因傳遞,碳點自身的熒光性能可將基因傳遞的過程可視化。陽離子化碳點有望開發(fā)為兼具基因傳遞與生物成像功能的新型非病毒納米基因載體。然而目前尚未有利用碳點作為非病毒納米基因載體應用于誘導細胞神經定向分化的研究,因此本課題以天然紫菜多糖為碳源,乙二胺為陽離子化試劑和表面鈍化劑,通過水熱法制備帶正電荷的碳點,并對碳點進行表征和基因載體性能的考察。在此基礎上,以碳點作為非病毒納米基因載體,將Ascl1、Brn2、Sox2質粒以不同的質粒組合導入外胚層間充質干細胞,進行細胞的定向神經誘導,體外獲得神經細胞,為由損傷或疾病引起的神經元損傷的治療提供種子細胞。此外,細胞的體內生長環(huán)境是三維體系,與一般的體外二維培養(yǎng)體系存在巨大差異,因此體外利用組織工程材料進行細胞的三維培養(yǎng)能最大程度模擬體內環(huán)境,為細胞體內移植奠定研究基礎。對于由外力沖擊造成的神經損傷,如脊髓損傷,損傷部位形成缺口,需要生物相容性好且有利于細胞粘附、增殖和遷移的組織工程支架攜載細胞移植到缺損部位進行損傷的修復治療,良好的組織工程支架能夠抑制細胞凋亡和組織損傷引起的炎癥反應,為神經再生提供良好的環(huán)境。為此本課題以海藻酸鈉和明膠為原料,通過調節(jié)不同的配方制備適合誘導性神經細胞生長的水凝膠,為后續(xù)將優(yōu)化的水凝膠攜載誘導性神經細胞移植至大鼠脊髓半橫斷部位進行脊髓損傷修復提供初步研究基礎。第一章綜述本章主要闡述了碳點的制備方法、理化性質以及目前的應用,重點介紹碳點優(yōu)異的理化性質以及在生物成像的應用,為碳點作為多功能非病毒納米基因載體的應用提供可行性參考;同時簡單介紹目前體外獲取神經細胞的方法,包括多能干細胞的定向分化和體細胞重編程,為利用碳點攜載特定質粒進行間充質干細胞轉染提供依據;介紹目前用于治療脊髓損傷的生物支架,為支架材料的選擇提供參考;最后提出課題的選題依據和思路,為論文工作的開展奠定基礎。第二章碳點的制備及表征本章采用紫菜多糖為原料,乙二胺作為陽離子修飾劑,通過水熱法制備陽離子化碳點。通過測定紫外-可見吸收光譜、熒光發(fā)射和激發(fā)光譜以及熒光量子產率,對碳點的熒光性能進行考察,紅外光譜和含氮量的測定說明了碳點的表面修飾和結構組成。本課題制備得到的碳點具有激發(fā)光波長依賴性熒光性質,在不同的激發(fā)光下顯示紅色,綠色和藍色三種熒光,碳點表面經陽離子化修飾,熒光量子產率高達56.3%,具有優(yōu)異的光學性能。第三章碳點的基因載體性能研究本章主要圍繞碳點的基因載體性能展開研究。通過瓊脂糖凝膠電泳考察陽離子化碳點對質粒DNA結合能力,碳點與質粒DNA以10:1的比例混合即可對DNA進行有效的結合。通過測定自組裝納米粒的粒徑、Zeta電位和掃描電鏡,對碳點/pDNA自組裝納米粒進行表征,結果顯示碳點的平均粒約徑為4 nm,自主裝納米粒約為14 nm,碳點和自組裝納米粒均帶正電荷,呈規(guī)則的球形,分散性好。此外,考察自組裝納米粒的毒性和細胞轉運機制,與市售的陽離子轉染試劑相比,自主裝納米粒的毒性更低,幾乎無細胞毒性;自組裝納米粒通過小窩蛋白和網格蛋白介導的內吞作用進入細胞,發(fā)揮基因傳遞的作用。第四章碳點/pDNA納米粒介導EMSCs向神經細胞定向分化研究本章以碳點作為基因載體,分別與由Ascl1、Brn2、Sox2組成的7組質粒組合自組裝形成納米粒,進行外胚層間充質干細胞(EMSCs)的轉染。通過觀察細胞形態(tài)變化,ELISA和Western blot測定特定神經蛋白的表達,確定最優(yōu)的轉染組合;經免疫熒光,免疫組化和RT-PCR鑒定誘導獲得的神經樣細胞。結果顯示,由Ascl1和Brn2組成的AB組合可更有效的誘導EMSCs向神經元樣細胞分化,誘導獲得的神經元樣細胞表達Tuj1,Map2,Tau,Gap-43和NF200;最后RT-PCR顯示,與市售的陽離子轉染試劑相比,碳點的細胞轉染效率更高,具有顯著性差異。第五章三維培養(yǎng)體系的初步探索本章以海藻酸鈉和明膠為原料,以CaCl_2為促凝劑,制備復合水凝膠。通過測定凝膠時間和細胞毒性,對45組水凝膠的凝膠性質和生物相容性進行初步評價。接著,測定水凝膠的吸水率,溶脹率和降解速率,考察水凝膠的物理性質,進一步篩選出最佳水凝膠配方。最后將轉染后的EMSCs與復合水凝膠混合成膠,制備載細胞水凝膠。觀察不同培養(yǎng)時間水凝膠上細胞的存活和生長情況,比較二維和三維細胞神經轉分化效率,初步考察水凝膠是否適宜細胞生長,為后續(xù)載細胞水凝膠的體內移植提供研究基礎。
【圖文】：

前驅體的種類可將碳點的制備方法分為而下法常以石墨[4]、碳納米管[5]等結構有法將其破碎成碳納米粒，其中的物理和]和電化學[8]法等。而自下而上法是將小其中包括：水熱法[9]，模板法[10]，微波用激光束的能量對碳前驅物進行照射和[13]采用激光照射石墨薄片，激光照射結分別為 3 nm，8 nm和 13 nm 的碳量子同的熒光顏色，且這三種碳量子點均具過控制激光脈沖寬度可以對碳點的尺寸影響了碳點的成核條件和生長。并且與光器更適合不同材料體系中納米結構的

圖 1.3 水熱法制備碳點[15]Figure 1.3 Preparation of CDs by hydrothermal method.1.1.4 模板法模板法是將碳前驅體置于模板的納米空間進行碳化，碳化后將納米粒與模離從而制備特定尺寸的碳點。碳納米材料的制備是在特定尺寸的模板上進行此制備得到的材料一致性好、高度有序。Yang 等[16]以普朗尼克 P123 作為板，有序的介孔氧化硅 SAB-15 作為硬模板，選取 1,3,5-三甲苯(TMB)、二(DAB)、芘(PY)和鄰二氮雜菲(PHA)作為碳源制備碳點。對制備得到的碳點氧化和鈍化修飾，，修飾后的碳點具有 3.3～4.7%的光致發(fā)光效率和超高的光性。利用特定納米尺寸的模板控制碳點的尺寸，在保證制備碳點的尺寸均一況下，通過多種有機前體對制備得到的碳點進行修飾，從而改變碳點結構、和發(fā)光特性，有助于進一步了解碳點表面態(tài)對碳點的發(fā)光的影響，從碳點表
【學位授予單位】：江蘇大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R741;R318.08

【參考文獻】

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2 鞠文博;李淑波;周艷;潘安娜;李大寧;;β-巰基乙醇在大鼠骨髓基質細胞向神經干細胞誘導分化中的作用[J];中國組織工程研究與臨床康復;2007年20期

3 孫晉浩,楊琳,高英茂;bFGF和EGF對胚胎神經干細胞分化為神經元及神經膠質細胞的影響[J];解剖學雜志;2002年03期

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1 陳海婷;三維打印海藻酸鈉/改性明膠復合水凝膠支架的制備與骨修復性能研究[D];華南理工大學;2018年

2 周婕;碳量子點介導的基因傳遞與體細胞神經分化研究[D];江蘇大學;2017年

本文編號：2596763