【摘要】：病毒載體存在誘發(fā)基因突變的風(fēng)險(xiǎn),而非病毒納米基因載體具有優(yōu)異的安全性,因此相關(guān)研究受到關(guān)注。近年來(lái),不少研究報(bào)道了應(yīng)用陽(yáng)離子化多糖作為基因載體攜載特定基因進(jìn)行細(xì)胞重編程。多糖具有良好的安全性和低細(xì)胞毒性,因此多糖來(lái)源的陽(yáng)離子化碳點(diǎn),不僅可實(shí)現(xiàn)安全的基因傳遞,碳點(diǎn)自身的熒光性能可將基因傳遞的過(guò)程可視化。陽(yáng)離子化碳點(diǎn)有望開(kāi)發(fā)為兼具基因傳遞與生物成像功能的新型非病毒納米基因載體。然而目前尚未有利用碳點(diǎn)作為非病毒納米基因載體應(yīng)用于誘導(dǎo)細(xì)胞神經(jīng)定向分化的研究,因此本課題以天然紫菜多糖為碳源,乙二胺為陽(yáng)離子化試劑和表面鈍化劑,通過(guò)水熱法制備帶正電荷的碳點(diǎn),并對(duì)碳點(diǎn)進(jìn)行表征和基因載體性能的考察。在此基礎(chǔ)上,以碳點(diǎn)作為非病毒納米基因載體,將Ascl1、Brn2、Sox2質(zhì)粒以不同的質(zhì)粒組合導(dǎo)入外胚層間充質(zhì)干細(xì)胞,進(jìn)行細(xì)胞的定向神經(jīng)誘導(dǎo),體外獲得神經(jīng)細(xì)胞,為由損傷或疾病引起的神經(jīng)元損傷的治療提供種子細(xì)胞。此外,細(xì)胞的體內(nèi)生長(zhǎng)環(huán)境是三維體系,與一般的體外二維培養(yǎng)體系存在巨大差異,因此體外利用組織工程材料進(jìn)行細(xì)胞的三維培養(yǎng)能最大程度模擬體內(nèi)環(huán)境,為細(xì)胞體內(nèi)移植奠定研究基礎(chǔ)。對(duì)于由外力沖擊造成的神經(jīng)損傷,如脊髓損傷,損傷部位形成缺口,需要生物相容性好且有利于細(xì)胞粘附、增殖和遷移的組織工程支架攜載細(xì)胞移植到缺損部位進(jìn)行損傷的修復(fù)治療,良好的組織工程支架能夠抑制細(xì)胞凋亡和組織損傷引起的炎癥反應(yīng),為神經(jīng)再生提供良好的環(huán)境。為此本課題以海藻酸鈉和明膠為原料,通過(guò)調(diào)節(jié)不同的配方制備適合誘導(dǎo)性神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)的水凝膠,為后續(xù)將優(yōu)化的水凝膠攜載誘導(dǎo)性神經(jīng)細(xì)胞移植至大鼠脊髓半橫斷部位進(jìn)行脊髓損傷修復(fù)提供初步研究基礎(chǔ)。第一章綜述本章主要闡述了碳點(diǎn)的制備方法、理化性質(zhì)以及目前的應(yīng)用,重點(diǎn)介紹碳點(diǎn)優(yōu)異的理化性質(zhì)以及在生物成像的應(yīng)用,為碳點(diǎn)作為多功能非病毒納米基因載體的應(yīng)用提供可行性參考;同時(shí)簡(jiǎn)單介紹目前體外獲取神經(jīng)細(xì)胞的方法,包括多能干細(xì)胞的定向分化和體細(xì)胞重編程,為利用碳點(diǎn)攜載特定質(zhì)粒進(jìn)行間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)染提供依據(jù);介紹目前用于治療脊髓損傷的生物支架,為支架材料的選擇提供參考;最后提出課題的選題依據(jù)和思路,為論文工作的開(kāi)展奠定基礎(chǔ)。第二章碳點(diǎn)的制備及表征本章采用紫菜多糖為原料,乙二胺作為陽(yáng)離子修飾劑,通過(guò)水熱法制備陽(yáng)離子化碳點(diǎn)。通過(guò)測(cè)定紫外-可見(jiàn)吸收光譜、熒光發(fā)射和激發(fā)光譜以及熒光量子產(chǎn)率,對(duì)碳點(diǎn)的熒光性能進(jìn)行考察,紅外光譜和含氮量的測(cè)定說(shuō)明了碳點(diǎn)的表面修飾和結(jié)構(gòu)組成。本課題制備得到的碳點(diǎn)具有激發(fā)光波長(zhǎng)依賴性熒光性質(zhì),在不同的激發(fā)光下顯示紅色,綠色和藍(lán)色三種熒光,碳點(diǎn)表面經(jīng)陽(yáng)離子化修飾,熒光量子產(chǎn)率高達(dá)56.3%,具有優(yōu)異的光學(xué)性能。第三章碳點(diǎn)的基因載體性能研究本章主要圍繞碳點(diǎn)的基因載體性能展開(kāi)研究。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳考察陽(yáng)離子化碳點(diǎn)對(duì)質(zhì)粒DNA結(jié)合能力,碳點(diǎn)與質(zhì)粒DNA以10:1的比例混合即可對(duì)DNA進(jìn)行有效的結(jié)合。通過(guò)測(cè)定自組裝納米粒的粒徑、Zeta電位和掃描電鏡,對(duì)碳點(diǎn)/pDNA自組裝納米粒進(jìn)行表征,結(jié)果顯示碳點(diǎn)的平均粒約徑為4 nm,自主裝納米粒約為14 nm,碳點(diǎn)和自組裝納米粒均帶正電荷,呈規(guī)則的球形,分散性好。此外,考察自組裝納米粒的毒性和細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制,與市售的陽(yáng)離子轉(zhuǎn)染試劑相比,自主裝納米粒的毒性更低,幾乎無(wú)細(xì)胞毒性;自組裝納米粒通過(guò)小窩蛋白和網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞,發(fā)揮基因傳遞的作用。第四章碳點(diǎn)/pDNA納米粒介導(dǎo)EMSCs向神經(jīng)細(xì)胞定向分化研究本章以碳點(diǎn)作為基因載體,分別與由Ascl1、Brn2、Sox2組成的7組質(zhì)粒組合自組裝形成納米粒,進(jìn)行外胚層間充質(zhì)干細(xì)胞(EMSCs)的轉(zhuǎn)染。通過(guò)觀察細(xì)胞形態(tài)變化,ELISA和Western blot測(cè)定特定神經(jīng)蛋白的表達(dá),確定最優(yōu)的轉(zhuǎn)染組合;經(jīng)免疫熒光,免疫組化和RT-PCR鑒定誘導(dǎo)獲得的神經(jīng)樣細(xì)胞。結(jié)果顯示,由Ascl1和Brn2組成的AB組合可更有效的誘導(dǎo)EMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化,誘導(dǎo)獲得的神經(jīng)元樣細(xì)胞表達(dá)Tuj1,Map2,Tau,Gap-43和NF200;最后RT-PCR顯示,與市售的陽(yáng)離子轉(zhuǎn)染試劑相比,碳點(diǎn)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率更高,具有顯著性差異。第五章三維培養(yǎng)體系的初步探索本章以海藻酸鈉和明膠為原料,以CaCl_2為促凝劑,制備復(fù)合水凝膠。通過(guò)測(cè)定凝膠時(shí)間和細(xì)胞毒性,對(duì)45組水凝膠的凝膠性質(zhì)和生物相容性進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。接著,測(cè)定水凝膠的吸水率,溶脹率和降解速率,考察水凝膠的物理性質(zhì),進(jìn)一步篩選出最佳水凝膠配方。最后將轉(zhuǎn)染后的EMSCs與復(fù)合水凝膠混合成膠,制備載細(xì)胞水凝膠。觀察不同培養(yǎng)時(shí)間水凝膠上細(xì)胞的存活和生長(zhǎng)情況,比較二維和三維細(xì)胞神經(jīng)轉(zhuǎn)分化效率,初步考察水凝膠是否適宜細(xì)胞生長(zhǎng),為后續(xù)載細(xì)胞水凝膠的體內(nèi)移植提供研究基礎(chǔ)。
【圖文】：

前驅(qū)體的種類(lèi)可將碳點(diǎn)的制備方法分為而下法常以石墨[4]、碳納米管[5]等結(jié)構(gòu)有法將其破碎成碳納米粒，其中的物理和]和電化學(xué)[8]法等。而自下而上法是將小其中包括：水熱法[9]，模板法[10]，微波用激光束的能量對(duì)碳前驅(qū)物進(jìn)行照射和[13]采用激光照射石墨薄片，激光照射結(jié)分別為 3 nm，8 nm和 13 nm 的碳量子同的熒光顏色，且這三種碳量子點(diǎn)均具過(guò)控制激光脈沖寬度可以對(duì)碳點(diǎn)的尺寸影響了碳點(diǎn)的成核條件和生長(zhǎng)。并且與光器更適合不同材料體系中納米結(jié)構(gòu)的

圖 1.3 水熱法制備碳點(diǎn)[15]Figure 1.3 Preparation of CDs by hydrothermal method.1.1.4 模板法模板法是將碳前驅(qū)體置于模板的納米空間進(jìn)行碳化，碳化后將納米粒與模離從而制備特定尺寸的碳點(diǎn)。碳納米材料的制備是在特定尺寸的模板上進(jìn)行此制備得到的材料一致性好、高度有序。Yang 等[16]以普朗尼克 P123 作為板，有序的介孔氧化硅 SAB-15 作為硬模板，選取 1,3,5-三甲苯(TMB)、二(DAB)、芘(PY)和鄰二氮雜菲(PHA)作為碳源制備碳點(diǎn)。對(duì)制備得到的碳點(diǎn)氧化和鈍化修飾，，修飾后的碳點(diǎn)具有 3.3～4.7%的光致發(fā)光效率和超高的光性。利用特定納米尺寸的模板控制碳點(diǎn)的尺寸，在保證制備碳點(diǎn)的尺寸均一況下，通過(guò)多種有機(jī)前體對(duì)制備得到的碳點(diǎn)進(jìn)行修飾，從而改變碳點(diǎn)結(jié)構(gòu)、和發(fā)光特性，有助于進(jìn)一步了解碳點(diǎn)表面態(tài)對(duì)碳點(diǎn)的發(fā)光的影響，從碳點(diǎn)表
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R741;R318.08

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2596763