發(fā)布時間：2020-03-23 04:05

【摘要】：背景腦出血(Intracerebral hemorrhage,ICH)具有高死亡率和致殘率的特點,約占所有中風的10-15%。越來越多的證據表明,ICH后免疫細胞的激活和促炎細胞因子的釋放,會引發(fā)過度的神經炎癥反應,導致血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)破壞和神經細胞死亡,BBB的破壞繼而又進一步加劇炎癥反應。因此,抑制腦部炎癥和維持BBB的完整性是ICH治療的關鍵策略。白細胞介素10(Interleukin-10,IL-10)主要由外周的單核細胞和腦部的小膠質細胞/巨噬細胞(microglia/macrophages,MMΦ)分泌,是一種重要的抗炎細胞因子,在炎癥反應中發(fā)揮重要的免疫調節(jié)功能。研究表明在中樞神經系統(tǒng)疾病(Central nervous system,CNS)中,IL-10在大腦中的表達上調會觸發(fā)多種信號傳導途徑抑制炎癥反應,進而達到保護神經元和膠質細胞的作用。另有研究報道,IL-10對血管內皮具有顯著的保護功能。然而,ICH后IL-10是否對BBB產生保護作用尚未見報道。BBB是外周循環(huán)和CNS之間的動態(tài)結構,由內皮細胞及其間的緊密連接、基膜、周細胞和星形膠質細胞終足組成。BBB保護大腦免受外周血液循環(huán)中有毒物質和病原體的侵害,并將營養(yǎng)物質輸送到大腦,維持神經系統(tǒng)微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。在ICH患者中,BBB通常在發(fā)病初始和晚期破壞,滲透性增加,加重病情;另一方面BBB的相對不可滲透性限制了許多有益藥物在相關治療濃度下到達中樞系統(tǒng),這使得BBB成為治療出血性中風的主要障礙之一。因此ICH后,在分子和細胞水平上研究BBB相關功能障礙的潛在機制顯得尤為重要。為研究ICH后BBB的治療靶點,建立合適的ICH動物模型顯得尤為重要。常用的ICH動物模型有自體血注入法(Blood intracerebral hemorrhage model,b-ICH)、膠原酶注入法(Collagenase intracerebral hemorrhage model,c-ICH)、微球囊充脹法和自發(fā)性ICH法。目前國內外最廣泛使用的是c-ICH和b-ICH模型。前者則是用膠原酶消化小血管的細胞外基質,劑量依賴性地導致血液外滲;b-ICH則是采小鼠尾動脈血原位注射到腦部核團。但基礎研究中,研究者常偏向于使用一種ICH模型,若選擇的模型不恰當,未能真正的將研究目的與人類中風的病理生理學特點相結合,會阻礙研究進展,因此開展實驗前選擇適合與ICH后BBB破壞過程相似的動物模型十分必要。ICH模型的穩(wěn)定性,與病人BBB的動態(tài)變化接近程度直接關系到ICH研究的科學性和實用性。目前,尚無研究在c-ICH和b-ICH兩種動物模型中進行BBB破壞特點的比較。因此,本實驗首先比較ICH后不同時間點c-ICH和b-ICH兩種模型BBB滲透性,緊密連接相關蛋白,水通道蛋白4(Aquaporin 4,AQP4)及破壞介質基質金屬蛋白酶9(Matrix metalloproteinases 9,MMP9)等的變化情況;本實驗的第二部分主要驗證ICH后,IL-10是否對BBB產生保護作用,并進一步探討其分子機制。本研究旨在解析ICH后BBB破壞的分子機制,證實IL-10的療效,為研究臨床上ICH病人的用藥時間窗和藥物的治療靶點提供參考價值。目的(1)通過建立兩種c-ICH和b-ICH動物模型,評價BBB損傷的動態(tài)變化,為模擬ICH病人提供可靠的動物模型。(2)研究IL-10對ICH后BBB的調節(jié)功能和分子機制,為臨床ICH后BBB損傷提供潛在的治療靶點。方法(1)分別建立c-ICH和b-ICH動物模型,評價術后運動功能。將小鼠分為sham組、c-ICH組和b-ICH組。通過優(yōu)化劑量比較兩組模型血腫大小,篩選出兩種模型血腫大小一致時所使用的膠原酶濃度和自體血體積。c-ICH組小鼠采用VII型膠原酶(0.05U)立體定位儀注射到小鼠左腦尾狀核,定位坐標為前囟前0.6mm,中線左側旁開2.1mm,距顱骨表面深度3.1mm;b-ICH組小鼠采用自體尾動脈血20μL原位注射到小鼠左腦尾狀核。模型建立穩(wěn)定后,比較三組小鼠術后6h,12h,D1,D3和D5神經行為學變化包括神經功能評分、前肢放置和轉角實驗。(2)評價c-ICH和b-ICH組ICH后BBB破壞特點,篩選與ICH病人BBB破壞程度接近的出血模型。ICH后6h,12h,D1,D3和D5,采用中分子染料伊文思藍(Evans blue,EB)和大分子免疫球蛋白IgG(160 Da)示蹤滲漏觀察sham、c-ICH和b-ICH三組小鼠在術后BBB組分的動態(tài)變化,比較c-ICH和b-ICH各自BBB破壞最嚴重的時間點;采用免疫印跡(Western blot,WB)和透射電鏡技術比較c-ICH和b-ICH緊密連接的完整性;明膠酶譜實驗比較兩種ICH模型術后MMP9的活性;qPCR技術檢測sham、c-ICH和b-ICH三組小鼠APQ4的動態(tài)表達。(3)論證鼻飼IL-10是否對ICH后小鼠神經功能和BBB具有保護作用。ICH手術后2h鼻飼IL-10(濃度:0.02ug/μL,0.1μg/mouse in 5μL PBS),一天兩次,直至D3取材。將實驗動物分為三組:sham組,ICH+PBS組和ICH+IL-10組。術后D3,觀察小鼠運動功能改變,包括神經功能評分和轉角實驗等。采用evans blue,WB實驗評價BBB滲透性,緊密連接蛋白occludin和cadherin-10的表達。(4)驗證IL-10是否可減少膠質細胞表達和促炎因子釋放。術后D3,采用免疫熒光分析鼻飼IL-10后血腫周圍小膠質細胞和星形細胞的激活,通過熒光計數(shù)統(tǒng)計分析膠質細胞激活情況。通過ELISA檢測腦組織中腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)表達。研究結果(1)ICH后6h,b-ICH組神經功能缺損評分(NDS)高于c-ICH組,神經運動功能損傷明顯,與c-ICH組顯著差異(P0.05),其他時間點兩組模型運動功能沒有差異。(2)術后6h,兩組模型血腫周圍均有EB滲漏,但c-ICH組在D3血腫周圍中EB和IgG滲漏最多,且腦水含量顯著高于b-ICH組(P0.05),b-ICH組則在D5滲漏達到峰值(P0.05)。(3)c-ICH組緊密連接蛋白occludin和cadherin-10的表達量在D3,b-ICH組在D5時明顯下調(P0.05);透射電鏡結果提示術后D3,c-ICH緊密連接變短,破壞嚴重,b-ICH組緊密連接D5破壞更嚴重,D3和D5兩組模型緊密連接破壞程度具有統(tǒng)計學差異(P0.05);c-ICH組和b-ICH腦組織MMP9活性在術后6h開始升高,但兩組在分別在D3和D5活性最高(P0.05);兩組模型腦組織的AQP4 mRNA表達量分別在術后D3和D5最高(P0.05)。(4)在c-ICH模型術后D3,IL-10治療能夠明顯改善ICH血腫大小和神經功能缺損(P0.05),降低BBB滲透(P0.05),上調緊密連接蛋白cadherin-10和occludin表達(P0.05)。(5)在c-ICH模型術后D3,IL-10可抑制血腫周圍小膠質細胞和星形膠質細胞激活(P0.05)和促炎因子TNF-α釋放(P0.05)。研究結論(1)c-ICH和b-ICH后BBB損傷最嚴重的時間點分別發(fā)生在ICH術后D3和D5;結合臨床ICH病人D1-D3腦水腫增高并達到峰值隨后緩慢降低的發(fā)病特征,提示c-ICH模型更適合作為研究臨床ICH病人腦水腫的預后的基礎模型。(2)本研究表明IL-10可抑制血腫周圍膠質細胞的激活和炎癥因子TNF-α的表達,上調cadherin-10和occludin蛋白,保護c-ICH模型中BBB的完整性。
【圖文】：

沒有延伸到其他核區(qū)域（圖 1.1A）。LFB/CV 染色結果表明 c-ICH 和 b-ICH兩組模型血腫體積大小基本一致，但前者血腫比較彌散，而后者則比較集中（圖1.1B）。血腫體積結果顯示兩組沒有統(tǒng)計學意義（4.664 ± 2.947 mm3vs 4.580 ±2.826 mm3；n = 8; P > 0.05;圖 1.1C）。

圖 1.2 ICH 后 6h，12h，D1，D3 和 D5，c-ICH 和 b-ICH 模型運動功能的比較（A）Sham組，c-ICH 組和 b-ICH 組死亡率。（B）術后 D1，D3 和 D5，三組模型體重比較（n=12; *P <0.05，**P < 0.01 vs. sham group；repeated measuresANOVAfollowed by Bonferroni post hoc test）。（C）神經功能缺損評分（n=12；*P < 0.05 vs. sham group，#P < 0.05 vs. c-ICH group；repeatedmeasuresANOVAfollowed by Bonferroni post hoc test）。（D）轉角實驗（n=12; *P <0.05 vs.sham group）。（E）前肢放置實驗（n=12; *P < 0.05 vs. sham group，repeated measuresANOVAfollowed by Bonferroni post hoc test）。1.4.3 c-ICH 和 b-ICH 模型 BBB 滲漏情況比較EB 染料可立即與血清中的白蛋白（67 kd）結合，因此被用來測量 BBB 的完整性。結果顯示 c-ICH 和 b-ICH 均在術后 6h 開始出現(xiàn) BBB 滲漏，c-ICH 在D3 時 EB 滲漏嚴重，而 b-ICH D5 EB 滲漏廣泛（圖 1.3A。c-ICH 和 b-ICH 兩組模型在術后 6h 時腦組織中 EB 濃度均開始升高，，但前者在 D3 達到最高，顯著高于后者（1.783 ± 0.392 vs 1.472 ± 0.149; P < 0.05; n = 4），而 b-ICH 組在 D5 最為嚴重顯著高于 c-ICH 組（1.879 ± 0.185 vs 1.216 ± 0.216; P < 0.05; n = 4；圖1.3B）。術后 D3，c-ICH 組腦水腫含量顯著高于嚴重于 b-ICH 組（82.012 ± 2.077
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R743.34

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